聶坤倫，何 利，速曉娟，邊金霖，郭金龍，杜 曉,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家茶檢中心(四川)研發(fā)中心，四川 雅安 625014；2.國(guó)家茶葉質(zhì)量檢驗(yàn)中心(四川籌)，四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

雅安藏茶是四川南路邊茶中的優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)產(chǎn)品，是使用優(yōu)質(zhì)原料、運(yùn)用傳統(tǒng)黑茶制作工藝、采取“渥堆”關(guān)鍵技術(shù)而形成其獨(dú)特感官品質(zhì)和豐富內(nèi)含成分的特色茶類。它既是藏區(qū)同胞生活中的重要物質(zhì)，也是內(nèi)地廣大消費(fèi)者認(rèn)為保健價(jià)值較高的傳統(tǒng)飲品。近年來，有研究者[1-2]認(rèn)為藏茶具有恢復(fù)胃動(dòng)力、腸動(dòng)力和消除胃腸疾患以及相當(dāng)?shù)目寡趸δ?，但較科學(xué)、系統(tǒng)地揭示其作用機(jī)理的研究開展甚少。因此，探索雅安藏茶的保健功能及其機(jī)理是一項(xiàng)緊迫且具有理論和實(shí)際價(jià)值的研究課題。

高通量篩選(high-throughput screening，HTS)是產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代后期的一種尋找新藥的高新技術(shù)，是以藥物作用靶點(diǎn)為主要對(duì)象的細(xì)胞和分子水平的篩選模型，根據(jù)樣品和靶點(diǎn)結(jié)合的表現(xiàn)，判斷化合物生物活性的技術(shù)方法[3-4]，應(yīng)用比較廣泛[5-8]。采用HTS進(jìn)行篩選的樣品主要有組合化學(xué)庫(kù)、天然化合物、化學(xué)合成化合物、反義核酸、肽核酸、可溶性蛋白等，目前已將生物芯片技術(shù)用于HTS藥物篩選研究，如正在改進(jìn)Caliper’s顯微流態(tài)芯片以用于HTS[9]。

α-淀粉酶是隨機(jī)水解α-1,4糖苷鍵的內(nèi)切型淀粉酶，通過對(duì)其抑制作用能減少高淀粉類物質(zhì)在人體消化道內(nèi)的消化和吸收，抑制餐后血糖水平的升高，間接減少體內(nèi)脂肪的合成。通過評(píng)價(jià)雅安藏茶及其級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果，從而間接探討樣品對(duì)降脂減肥的功效。本實(shí)驗(yàn)以α-淀粉酶為研究對(duì)象，將高通量篩選技術(shù)運(yùn)用于雅安藏茶級(jí)分抑制α-淀粉酶活性成分的篩選，一方面間接驗(yàn)證雅安藏茶具有良好的降糖降脂作用，另一方面為藏茶制品在調(diào)理人體腸道代謝機(jī)理的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雅安藏茶成品茶由雅安市友誼茶業(yè)有限公司提供。

α-淀粉酶 美國(guó)Sigma公司；氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、甲醛、濃鹽酸、碘酸鉀、碘化鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Tex ELX800酶標(biāo)儀 上海珂淮儀器有限公司；UV-2300紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；AX200微量電子天平 東西儀(北京)科技有限公司；移液槍 上海佳安分析儀器廠；96孔培養(yǎng)板 北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海人和科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雅安藏茶各級(jí)分的分離制備

雅安藏茶級(jí)分是指利用雅安藏茶中不同成分在互不相溶的兩相溶劑中的溶解度不同，即根據(jù)分配系數(shù)的差異，通過萃取而初步分離的粗提物。

圖 1 雅安藏茶不同級(jí)分的提取、分離流程圖Fig.1 Extraction process of Ya’an Tibetan tea

取雅安藏茶磨碎干樣2000g，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液6000mL，浸提約40min過濾，共浸提4次，得到濾液22740mL，加熱至(50±5)℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓回收乙醇，得到濃縮水溶液約3500mL。再將濃縮水溶液用圖1所示的系列溶劑以1：1比例萃取分離，首先經(jīng)石油醚脫脂后得石油醚層溶液和水層溶液，接著將水層溶液加入氯仿萃取2次，得到氯仿層溶液和凈化水溶液；凈化水溶液再用乙酸乙酯萃取2次，得到乙酸乙酯層溶液和水溶液；然后將乙酸乙酯層先后用1% NaHCO3和乙醚萃取，分別得到乙醚層、乙醚萃取的水層和碳酸氫鈉水層級(jí)分；與此同時(shí)將水溶液用正丁醇萃取分別得到正丁醇層和正丁醇萃取的水層級(jí)分。最后將所得溶液分別經(jīng)回收萃取液和減壓真空干燥制得各級(jí)分樣品。

1.3.2 雅安藏茶級(jí)分成分含量測(cè)定

從雅安藏茶中分離出的7種級(jí)分中主要含有兒茶素、咖啡堿、茶色素及氨基酸等茶葉有效成分。各級(jí)分中主要成分的含量分別由以下方法測(cè)定[10-11]：兒茶素總量采用香莢蘭比色法測(cè)定；咖啡堿含量采用紫外分光光度法測(cè)定；茶色素(茶黃素、茶紅素、茶褐素)含量采用系統(tǒng)比色法測(cè)定；游離氨基酸總量采用茚三酮比色法測(cè)定；水浸出物總量采用全量法測(cè)定。

1.3.3 α-淀粉酶的活性比較

1.3.3.1 雅安藏茶級(jí)分活性的篩選

參考高通量篩選原理，采用酶標(biāo)儀，用96孔板篩選雅安藏茶7種級(jí)分的不同梯度試液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果，從而判斷不同級(jí)分的活性。采用碘-淀粉間接比色法檢測(cè)[12]，即將雅安藏茶7種級(jí)分分別制成質(zhì)量濃度梯度的試液，在其中加入適當(dāng)?shù)牡矸酆挺?淀粉酶液，利用α-淀粉酶催化底物淀粉分解產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及α-1,6糖苷鍵支鏈的糊精，而未被酶分解的殘余淀粉與碘試劑作用生成藍(lán)色復(fù)合物，該反應(yīng)于96孔板上進(jìn)行，碘-淀粉復(fù)合物藍(lán)色深淺程度由酶標(biāo)儀所測(cè)定的660nm波長(zhǎng)處吸光度表示。當(dāng)所添加的雅安藏茶級(jí)分溶液對(duì)α-淀粉酶活性有抑制作用時(shí)，酶標(biāo)儀所測(cè)定的吸光度將增加，并且有量效關(guān)系，以此評(píng)價(jià)不同濃度級(jí)分的活性強(qiáng)弱。試液質(zhì)量濃度是活性測(cè)定的重要條件之一，使用酶標(biāo)儀，用96孔板分別對(duì)雅安藏茶水浸出物和7種級(jí)分，分別抑制從0.001～0.060mg/mL的質(zhì)量濃度范圍，共計(jì)40個(gè)質(zhì)量濃度梯度，于96孔板中形成反應(yīng)體系，用酶標(biāo)儀測(cè)定A660nm，并將吸光度控制在0.10～0.75范圍內(nèi)，從而確定雅安藏茶級(jí)分的添加質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 α-淀粉酶活力的測(cè)定

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定酶活力測(cè)定條件，即分別設(shè)定12個(gè)添加試液的測(cè)定組(U)和12個(gè)不添加試液的空白組(B)，分別加入質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的淀粉緩沖液(pH7.5)50μL、濃度為0.01mol/L的碘稀釋液50μL和藏茶級(jí)分供試液(供試液質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，按0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL加入)，向測(cè)定組加入質(zhì)量濃度為1mg/mL的酶液10μL，蒸餾水250μL，空白組因未加酶液，則加入蒸餾水260μL，混勻后在37℃中保溫7.5min，于波長(zhǎng)660nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定試液吸光度，以蒸餾水調(diào)零，重復(fù)處理3次。

因其所添加的雅安藏茶水浸出物有顏色，故在測(cè)定組及空白組分別加入相同質(zhì)量濃度的雅安藏茶水浸出物溶液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定測(cè)定體系中水浸出物質(zhì)量濃度分別為：0.000、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075、0.090、0.105、0.120、0.135、0.150、0.165mg/mL；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定測(cè)定反應(yīng)體系中雅安藏茶級(jí)分的12個(gè)梯度質(zhì)量濃度分別為：0.000、0.003、0.006、0.008、0.011、0.014、0.017、0.019、0.022、0.025、0.028、0.030mg/mL。

1.3.3.3 試液配制

雅安藏茶級(jí)分溶液的配制：從各級(jí)分樣品中準(zhǔn)確稱取0.100g用蒸餾水定容至100mL。

茶樣供試溶液制備：準(zhǔn)確稱取磨碎茶樣1.000g，加100mL沸蒸餾水，在100℃恒溫水浴中浸提45min，冷卻，過濾，靜置30min，作為供試茶樣溶液備用[13]。

α-淀粉酶溶液的配制：取100mg淀粉酶，加蒸餾水充分溶解，再用pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容至100mL容量瓶中，配成1mg/mL的溶液備用。

碘溶液的配制：稱取1.784g碘酸鉀和22.5g碘化鉀，溶于去離子水中，再緩慢加入4.5mL濃鹽酸，用去離子水稀釋至500mL，充分混勻，貯于棕色瓶中，每月配制新鮮溶液，置冰箱中保存(此為碘貯備液)，取碘貯備液用去離子水稀釋10倍，貯于棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配(此為碘稀釋液)。

1.3.3.4 α-淀粉酶活力測(cè)定

α-淀粉酶活力定義為：100mL酶液中的酶，在37℃與底物淀粉反應(yīng)7.5min，水解10mg淀粉為1個(gè)α-淀粉酶活力單位(U)。抑制率IC50值定義為：α-淀粉酶的抑制率達(dá)到50%時(shí)雅安藏茶水浸出物及其級(jí)分的質(zhì)量濃度(mg/mL)。α-淀粉酶活力按式(1)計(jì)算。

式中：AU為測(cè)定組的吸光度；AB為空白組的吸光度；800為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雅安藏茶不同級(jí)分中的有效成分含量

表 1 雅安藏茶級(jí)分所含有的主要有效成分含量Table 1 Major active component concentrations in Ya’an Tibetan tea%

從雅安藏茶中萃取分離得到7種不同的藏茶級(jí)分，通過對(duì)各個(gè)級(jí)分中有效成分的測(cè)定，可以為判斷不同級(jí)分抑制α-淀粉酶的主要因素提供依據(jù)。為此，測(cè)定了雅安藏茶各個(gè)級(jí)分的兒茶素總量、咖啡堿含量、茶色素組分含量及游離氨基酸總量，見表1。結(jié)果表明，雅安藏茶分離得到的氯仿級(jí)分主要是咖啡堿，其含量高達(dá)59.84%；乙醚級(jí)分主要含兒茶素，其含量高達(dá)67.32%；正丁醇萃余的水級(jí)分中主要是兒茶素、茶褐素和氨基酸，其含量分別為8.16%、5.62%和4.46%；茶褐素主要存在于正丁醇級(jí)分和石油醚級(jí)分中，其含量分別為9.20%和9.11%；茶紅素主要存在于正丁醇級(jí)分中，含量為15.19%，是茶色素中含量最高的組分。

2.2 雅安藏茶水浸出物抑制α-淀粉酶活力的效果

圖 2 不同質(zhì)量濃度雅安藏茶水浸出物對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of various extraction fractions from Ya’an Tibetan tea on α-amylase activity

圖 3 不同質(zhì)量濃度雅安藏茶水浸出物對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響Fig.3 Inhibitory effects of various extraction fractions from Ya’an Tibetan tea on α-amylase activity

茶葉水浸出物是指用熱水浸提的茶葉有效物質(zhì)總量，即日常飲茶可以攝入的物質(zhì)。由圖2可知，雅安藏茶水浸出物對(duì)α-淀粉酶活性有明顯的抑制作用。隨著雅安藏茶水浸出物添加質(zhì)量濃度的增大，α-淀粉酶活性明顯下降，呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)試液添加質(zhì)量濃度在0.120～0.150mg/mL范圍時(shí)量效曲線接近直線，α-淀粉酶的活性下降幅度較快；當(dāng)水浸出物添加質(zhì)量濃度達(dá)到0.165mg/mL時(shí)，α-淀粉酶活性達(dá)到最小值，僅為23.84U。由圖3可知，隨著水浸出物質(zhì)量濃度的增加，其抑制率逐漸上升，呈劑量依賴性。在0.045～0.120mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其抑制率上升較緩慢；但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.120～0.150mg/mL時(shí)，α-淀粉酶的抑制率顯著增大，在水浸出物質(zhì)量濃度達(dá)到0.165mg/mL時(shí)，雅安藏茶對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)96.24%，IC50值為0.125mg/mL，這表明，雅安藏茶水浸出物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用十分顯著；且這個(gè)質(zhì)量濃度范圍還低于日常飲用質(zhì)量濃度5.0mg/mL，表明正常飲用雅安藏茶也具有類似效果。

2.3 雅安藏茶級(jí)分抑制α-淀粉酶活性的效果

2.3.1 不同雅安藏茶級(jí)分抑制α-淀粉酶活性的作用

雅安藏茶各級(jí)分對(duì)α-淀粉酶均具有不同程度抑制作用，其抑制能力高低順序?yàn)椋阂颐鸭?jí)分≈乙醚萃余水級(jí)分＞氯仿級(jí)分≈正丁醇級(jí)分≈石油醚級(jí)分＞正丁醇萃余水級(jí)分＞碳酸氫鈉水級(jí)分(F=30.30＞F0.01(6,66)=3.19，P＜0.01)。這是由于不同級(jí)分中所含內(nèi)含物成分種類與含量不同，其抑制作用大小表現(xiàn)不同。結(jié)合表1中各級(jí)分中主要成分測(cè)定結(jié)果可以認(rèn)為，雅安藏茶的各個(gè)級(jí)分中以乙醚級(jí)分和乙醚萃余的水級(jí)分主要含兒茶素類物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)；氯仿級(jí)分因含有大量的咖啡堿對(duì)α-淀粉酶的抑制作用也很強(qiáng)；正丁醇級(jí)分和石油醚級(jí)分主要含茶褐素和部分兒茶素類，其對(duì)α-淀粉酶也有一定程度的抑制作用；正丁醇萃余水級(jí)分主要含游離氨基酸、茶褐素和少量?jī)翰杷兀瑢?duì)α-淀粉酶抑制作用極小，而碳酸氫鈉水級(jí)分雖然含有一定的茶紅素和兒茶素，但對(duì)α-淀粉酶的抑制作用不明顯。

2.3.2 不同質(zhì)量濃度雅安藏茶級(jí)分抑制α-淀粉酶的效果

圖 4 雅安藏茶乙醚級(jí)分、乙醚萃余水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig.4 Effect of extraction fractions in ether layer and water layer on activity of α-amylase

圖 5 雅安藏茶乙醚級(jí)分、乙醚萃余水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響Fig.5 Inhibitory effect of extraction fractions in ether layer and water layer on α-amylase

由圖4、5可知，乙醚級(jí)分和乙醚萃余的水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用隨級(jí)分質(zhì)量濃度增加而逐漸增大。在質(zhì)量濃度0.000～0.031mg/mL范圍內(nèi)，乙醚級(jí)分使α-淀粉酶酶活力大大降低，由634.40U下降到126.77U，其抑制率達(dá)到80.02%，IC50值為0.012mg/mL。在同一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，乙醚萃余的水級(jí)分使α-淀粉酶酶活力從634.40U下降到111.06U，抑制率上升到82.49%，其IC50值為0.022mg/mL。

圖 6 正丁醇級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活力的作用Fig.6 Effect of extraction fractions in n-butanol layer on α-amylase activity

由圖6 可知，正丁醇級(jí)分加入的質(zhì)量濃度在0.000～0.006mg/mL范圍內(nèi)，α-淀粉酶活性雖有小幅增加，當(dāng)其質(zhì)量濃度超過0.006mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增大，α-淀粉酶活性呈顯著下降趨勢(shì)。在質(zhì)量濃度為0.031mg/mL時(shí)，此時(shí)α-淀粉酶活性降到416.47U。

圖 7 氯仿級(jí)分、碳酸氫鈉水級(jí)分、正丁醇萃余水級(jí)分與石油醚級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活力的作用Fig.7 Effect of extraction fractions in chloroform layer, n-butanol layer, petroleum ether layer and sodium bicarbonate layer on α-amylase activity

由圖7可知，氯仿級(jí)分、正丁醇萃余的水級(jí)分和石油醚級(jí)分均隨著添加質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用是先增大至最大值后逐漸降低，揭示出這3種級(jí)分各質(zhì)量濃度間存在一個(gè)最佳質(zhì)量濃度值，分別為：氯仿級(jí)分0.017mg/mL、正丁醇萃余水級(jí)分0.008mg/mL、石油醚級(jí)分0.025mg/mL；而1%碳酸氫鈉水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性作用影響不明顯。

2.4 雅安藏茶抑制α-淀粉酶活性成分的篩選

2.4.1 用化學(xué)分析法篩選α-淀粉酶活性成分

如表2所示，對(duì)α-淀粉酶的抑制作用較大的為乙醚級(jí)分和乙醚萃余水級(jí)分。這兩者中所含主要成分中以兒茶素含量最高，而相應(yīng)的抑制作用最小的正丁醇萃余水級(jí)分中茶多酚含量最低，得出兒茶素的含量與雅安藏茶對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用有相關(guān)性。有研究者[14-15]在體外實(shí)驗(yàn)中研究茶多酚對(duì)各種糖降解酶活性的影響，認(rèn)為其能顯著抑制蔗糖酶和葡萄糖苷酶的活性，而茶多酚抑制小腸對(duì)碳水化合物的消化吸收，是通過對(duì)葡萄糖苷酶、蔗糖酶和淀粉酶活性的抑制實(shí)現(xiàn)的。此外有研究報(bào)道[16-19]稱，α-淀粉酶抑制劑主要是單寧、多酚類和蛋白質(zhì)或多肽，試樣中這些內(nèi)含物的多少直接或間接地影響著α-淀粉酶抑制劑的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上觀點(diǎn)一致。此外，氯仿級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用也較高(其最高抑制率達(dá)到50.24%)，表明咖啡堿也是抑制α-淀粉酶活性成分之一。

表 2 雅安藏茶級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的最大抑制率Table 2 Maximum inhibitory rate of Ya’an Tibetan tea extraction fractions on α-amylase activity

2.4.2 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型篩選α-淀粉酶活性成分

依據(jù)式(2)的一次多項(xiàng)式回歸模型，以雅安藏茶級(jí)分中所含有效成分對(duì)α-淀粉酶活性作用進(jìn)行分析。

式中：各級(jí)分內(nèi)含成分含量為自變量(X1：氨基酸；X2：咖啡堿；X3：茶黃素；X4：茶紅素；X5：茶褐素；X6：兒茶素)；α-淀粉酶最大抑制率為因變量y。利用逐步回歸的矩陣變換計(jì)算方法建立雅安藏茶級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性作用的數(shù)學(xué)模型。

依據(jù)式(3)，采用無代回的高斯-約當(dāng)消去法求解正規(guī)方程組。

式中：已引入變量以及其F 值為X2(F=1.3 2)、X5(F=11.80)、X6(F=11.32)；式中R2=0.983、F=7.36，在此顯著水平條件下剔除非顯著相關(guān)項(xiàng)X1、X3、X4。

為了考察因變量y與自變量X之間的因果關(guān)系，進(jìn)一步進(jìn)行了通徑分析。將相關(guān)系數(shù)分解為直接作用系數(shù)和間接作用系數(shù)，以此揭示各因素對(duì)因變量的相對(duì)重要性。建立在通徑系數(shù)概念上的通徑分析比相關(guān)分析和回歸分析更準(zhǔn)確地分析雅安藏茶級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性作用的數(shù)學(xué)模型。

通過對(duì)以上的相關(guān)系數(shù)矩陣的轉(zhuǎn)化，求解出標(biāo)準(zhǔn)化正規(guī)方程，進(jìn)而求出通徑系數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表 3 各顯著影響因素的通徑系數(shù)Table 3 Path coeffi cients of factors

通過各顯著影響因素的通徑系數(shù)可知，各因子成分對(duì)α-淀粉酶活性作用大小差異明顯，其對(duì)α-淀粉酶活性抑制能力依次為兒茶素＞茶褐素＞咖啡堿。

有研究[13,20]表明，茶多酚抑制α-淀粉酶作用的機(jī)理可能是：茶多酚是多羥基類化合物，羥基中具有一對(duì)孤對(duì)電子，易于對(duì)缺電子原子或原子團(tuán)發(fā)生親核進(jìn)攻，共價(jià)鍵合，形成茶多酚-酶復(fù)合物，改變了α-淀粉酶的構(gòu)象，從而抑制其活性，因?yàn)閮翰杷厥遣瓒喾拥闹黧w物質(zhì)，因而對(duì)α-淀粉酶也有抑制作用。而咖啡堿可以從其具有苯胺片段和C＝O的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其作為過渡類似物與α-淀粉酶有緊密結(jié)合，同時(shí)又與兒茶素結(jié)合產(chǎn)生沉淀等兩方面來考慮其對(duì)α-淀粉酶活性的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明α-淀粉酶活性抑制率與茶多酚的組成有關(guān)。茶多酚主要是由兒茶素、表兒茶素、茶褐素及其不同聚合度的混合物組成，具有較寬分子質(zhì)量分布范圍。不同聚合度的成分存在分子結(jié)構(gòu)及其相互作用力的差異，并表現(xiàn)出分子極性大小不同，以及在溶劑中的溶解度差異。多聚縮合組分相對(duì)分子質(zhì)量較大，帶有更多的酚羥基數(shù)目，與水分子間氫鍵結(jié)合作用強(qiáng)，所以其易于溶于水層。因此乙醚萃余水級(jí)分主要含有大分子量多聚縮合成分，其酚羥基數(shù)多，可以與α-淀粉酶形成多點(diǎn)結(jié)合，使酶分子構(gòu)型發(fā)現(xiàn)較大程度的改變，從而使酶活性受到較大程度的抑制。兒茶素、表兒茶素以及低聚縮合組分所帶的酚羥基數(shù)目較少，相對(duì)分子質(zhì)量較小，極性相對(duì)較弱，因此易溶于弱極性的乙醚溶劑，使乙醚級(jí)分抑制α-淀粉酶的能力低于乙醚萃余水級(jí)分。

此外，有文獻(xiàn)[21]提出黑茶在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一種普諾爾成分，這種成分能起到防止脂肪堆積的作用。何學(xué)斌等[22]提出茶多糖在體外對(duì)α-淀粉酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴性，雅安藏茶中可能還有其他物質(zhì)抑制α-淀粉酶活性。雅安藏茶不同級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制能力，取決于不同部位和α-淀粉酶蛋白的結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)還受諸多因素的影響，例如α-淀粉酶蛋白的構(gòu)象、體系反應(yīng)中底物的質(zhì)量濃度、溫度、pH值等，這些都還有待于進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

雅安藏茶級(jí)分對(duì)α-淀粉酶的抑制情況為：乙醚級(jí)分與乙醚萃余水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用最大，并且隨其質(zhì)量濃度的增加其抑制作用逐漸增大；氯仿級(jí)分、正丁醇級(jí)分、正丁醇萃余水級(jí)分和石油醚級(jí)分對(duì)α-淀粉酶均有一定程度的抑制作用且隨其質(zhì)量濃度的增大，對(duì)α-淀粉酶的影響有時(shí)表現(xiàn)為抑制，有時(shí)又表現(xiàn)為激活。這種變化可能原因在于雅安藏茶級(jí)分和酶結(jié)合時(shí)相互之間存在選擇性[23]，這種選擇性結(jié)合反映出抑制率的大小差別，各級(jí)分對(duì)α-淀粉酶不僅表現(xiàn)出抑制作用，有時(shí)也表現(xiàn)出激活作用。而碳酸氫鈉水級(jí)分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用不明顯。用化學(xué)分析法結(jié)合建立數(shù)學(xué)模型的方法從雅安藏茶級(jí)分篩選抑制α-淀粉酶活性成分為兒茶素、茶褐素和咖啡堿，且其抑制能力依次為兒茶素＞茶褐素＞咖啡堿。高通量篩選是近年發(fā)展起來的藥物篩選新方法，集計(jì)算機(jī)控制、自動(dòng)化操作、高靈敏檢測(cè)、數(shù)據(jù)結(jié)果和自動(dòng)采集和處理于一體，成為目前尋找新藥的重要手段[24-25]。本研究以高通量篩選法技術(shù)，運(yùn)用酶標(biāo)儀96孔板測(cè)定了7種雅安藏茶不同質(zhì)量濃度級(jí)分的酶活性值，同時(shí)結(jié)合各有效成分的測(cè)定值篩選雅安藏茶抑制α-淀粉酶的活性成分。采用了HTS技術(shù)測(cè)定雅安藏茶水浸出物及其級(jí)分對(duì)α-淀粉酶的活性的抑制作用，不僅大大縮短了時(shí)間，提高了篩選效率，而且還節(jié)約了樣品材料，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

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