成紀予，楊虎清

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安311300)

楊梅(Myrica rubra Sieb.et zucc.)屬于漿果，果實富含花青素，色澤誘人，酸甜適宜，風(fēng)味獨特，具有宜人的香氣。矢車菊-3-葡萄糖苷是楊梅中主要的花青素類物質(zhì)，占95% 以上［1］，是主要的活性有效成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗癌等方面的功能作用［2-4］。楊梅可鮮食，也可以加工成飲料、果酒、果脯等多種產(chǎn)品形式，其中以果汁產(chǎn)品為主。隨著加工量的增加，每年會產(chǎn)生占鮮重25%左右的楊梅果渣。目前這些果渣還未能得到充分有效的利用，造成資源的巨大浪費，同時也嚴重污染環(huán)境。而楊梅果渣中含有豐富的矢車菊素-3-葡萄糖苷［5］，且對于楊梅果渣中矢車菊素-3-葡萄糖苷的提取研究尚未見報道。因此，本研究以楊梅果渣為原料，采用有機溶劑浸提并結(jié)合超聲波處理提取矢車菊-3-葡萄糖苷，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定適宜的提取條件，為今后的楊梅果渣的深度開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楊梅(品種:荸薺) 采摘后立即運送到實驗室，經(jīng)榨汁去核后，得到新鮮的楊梅果渣，干燥、粉碎，過60 目篩備用;矢車菊-3-葡萄糖苷 Sigma 公司;甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純;乙醇 分級純;實驗室用水均為超純水。

DFT-200 手提式高速中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司;Waters 2695 液相色譜色譜儀 美國Waters 公司;KQ-250B 型超聲波清洗機超聲 江蘇昆山超聲儀器有限公司。

1.2 提取方法

準確稱取5g 楊梅渣，轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶內(nèi)，用提取溶劑定容到100mL，置于超聲波發(fā)生器固定位置，超聲波的水位亦要固定，在設(shè)定的溫度和時間進行超聲波(40kHz，250W)處理。提取結(jié)束，真空抽濾，濾液待測。

1.2.1 單因素影響

1.2.1.1 乙醇濃度 分別以20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液為提取溶劑，提取溫度為40℃，超聲40min。

1.2.1.2 提取溫度 以60%乙醇溶液為提取溶劑，分別在30、40、50、60、70、80℃下提取，超聲40min。

1.2.1.3 提取時間 以60%乙醇溶液為提取溶劑，在60℃下，分別超聲20、30、40、50、60、70、90、110min。

1.2.2 Box-Behnken 實驗設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以乙醇濃度、提取溫度、提取時間作為考察因子，進行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素與水平見表1。

表1 因素與水平表Table 1 Table of factors and levels

1.3 矢車菊-3-葡萄糖苷含量的測定

將提取液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾后，用高效液相色譜測定矢車菊-3-葡萄糖苷含量。色譜條件［6］:ODS 柱(250mm ×4.6mm i.d.，5μm)，流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B 為80%乙腈水溶液;采用梯度洗脫:0～30min，流動相B 由0 變化為66%;檢測波長為520nm，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10μL。矢車菊-3-葡萄糖苷對照品的高效液相圖譜如圖1 所示。根據(jù)出峰面積建立矢車菊-3-葡萄糖苷濃度(x，mg/mL)與峰面積(y)之間的回歸方程:y =1E +9x-42795(R2=0.9994)。根據(jù)下式計算矢車菊-3-葡萄糖苷得率:

得率(mg/g)= 矢車菊- 3 - 葡萄糖苷濃度(mg/mL)×提取液體積(mL)/原料質(zhì)量(g)

圖1 矢車菊-3-葡萄糖苷對照品(A)及樣品(B)的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of cyanidin-3-glucoside standard(A)and sample(B)

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響

由圖2 可知，含有適量水的乙醇溶液有利于增加楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷的得率。當乙醇濃度從20%增加到60%時，矢車菊-3-葡萄糖苷的得率從2.88mg/g 提高到3.95mg/g。當乙醇濃度達到80%，得率降低到3.65mg/g。當用95%的乙醇溶液提取時，一些極性較低的物質(zhì)同時被提取，這可能導(dǎo)致降低了楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷的得率。

圖2 乙醇濃度對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of cyanidin-3-glucoside

2.2 提取溫度對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響

提取溫度對楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響見圖3。在30～60℃溫度范圍，矢車菊-3-葡萄糖苷的得率隨著溫度增高而逐漸提高，從3.68mg/g 增加到4.28mg/g。但在更高的溫度下，一方面矢車菊-3-葡萄糖苷容易受到破壞，另一方面使其它物質(zhì)的溶出量增加，從而導(dǎo)致得率降低。

圖3 提取溫度對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of cyanidin-3-glucoside

2.3 提取時間對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響

提取時間對楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響見圖4。提取時間從10min 延長到70min，可觀察到矢車菊-3-葡萄糖苷的得率增加，從2.14mg/g提高到4.35mg/g。提取時間從70min 延長到90min，得率的增加不明顯。提取時間進一步延長，發(fā)現(xiàn)得率反而略微降低，這可能是因為矢車菊-3-葡萄糖苷在長時間的熱和光作用下容易被破壞所致。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗條件

在以上單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 三因素三水平實驗設(shè)計，其實驗結(jié)果見表2。根據(jù)所得實驗結(jié)果，利用Design-Expert 7.0.0軟件回歸擬合實驗數(shù)據(jù)，獲得以下的三元二次回歸模型。

圖4 提取時間對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of cyanidin-3-glucoside

表2 Box-Behnken 實驗結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiment

由表3 的方差分析結(jié)果可知，本實驗所選用的模型極顯著(p ＜0.001)，方程失擬項不顯著(p =0.0818 ＞0.05)，且該模型決定系數(shù)R2=0.9983，表明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，說明各因素值與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化，可以應(yīng)用于楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷提取的理論預(yù)測。由F 檢驗可知，各因素的貢獻率為:提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度。乙醇濃度和提取溫度、乙醇濃度和提取時間、提取溫度和時間之間存在著交互作用，如圖5所示。

應(yīng)用響應(yīng)面法對回歸模型進行分析，預(yù)測的最優(yōu)工藝參數(shù)為:乙醇濃度53%，溫度67℃，時間67min，響應(yīng)面最優(yōu)值為5.32mg/g。為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件下進行3 次平行實驗，矢車菊-3-葡萄糖苷得率為5.25mg/g，與預(yù)測值非常接近，說明響應(yīng)值的實際測量值與回歸模型預(yù)測值吻合度好。

圖5 各因素交互作用對矢車菊-3-葡萄糖苷得率的影響規(guī)律Fig.5 Effect rules of interaction of factors on extraction rate of cyanidin-3-glucoside

3 結(jié)論

本文在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實驗設(shè)計法對楊梅渣中矢車菊-3-葡萄糖苷的提取工藝進行了響應(yīng)面優(yōu)化。研究結(jié)果表明，乙醇濃度和提取溫度、乙醇濃度和提取時間、提取溫度和時間之間存在著交互作用;最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度53%，溫度67℃，時間67min。經(jīng)過驗證實驗可知，在最優(yōu)提取工藝條件下，矢車菊-3-葡萄糖苷得率可達5.25mg/g，與回歸模型的預(yù)測值相比，相對誤差＜1%，可為進一步的中試以及工業(yè)化制備提供理論基礎(chǔ)。

［1］葉興乾，陳健初，蘇平.荸薺種楊梅的花色苷組分鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，20(2)，188-190.

［2］曾林釵，高潔，張瑞.矢車菊素-3-葡萄糖苷抑制體內(nèi)外卵巢癌生長的作用［J］.中國中藥雜志，2012，37(11):1651-1654.

［3］Shih P H，Yeh C T，Yen G C.Effects of anthocyanidin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2005，43(10):1557-1566.

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regressive model

［4］Meiers S，Kemény M，Weyand U，et al.The anthocyanidins cyanidin and delphinidin are potent inhibitors of the epidermal growth- factor receptor［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(2):958-962.

［5］Zhou S Z，Lü Y，Chen J，Liu D，et al. Phenolics and antioxidant properties of bayberry(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)pomace［J］.Food Chemistry，2009，112:394-399.

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