王長遠，周 靜

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319)

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)和多肽水解的一類酶，種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶在工業(yè)用酶中非常廣泛，約占整個酶制劑市場的60% 以上，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織和洗滌等領(lǐng)域［1］。豆豉源于我國，由黃豆和黑豆為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，研究中發(fā)現(xiàn)參與細菌型豆豉發(fā)酵的微生物主要為豆豉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌與微球菌，并且發(fā)現(xiàn)這些菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種蛋白酶［2-3］。而微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)蛋白酶的主要方法，因此提高微生物產(chǎn)酶能力和高產(chǎn)蛋白酶菌株的選育顯得尤為重要。誘變育種是菌種選育研究中最常采用的技術(shù)手段，它不僅可以提高菌株的生產(chǎn)能力，而且還可以改進產(chǎn)品的質(zhì)量，擴大品種，簡化工藝［4］。本實驗從市售豆豉中分離出產(chǎn)蛋白酶菌株，并采用紫外誘變方法進行選育，提高菌株的產(chǎn)蛋白酶能力，以期為后續(xù)實驗提供高效菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 大慶市某超市購買;福林酚試劑 上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;酪氨酸 Sigma 公司;干酪素 上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;斜面培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂45g，蒸餾水1000mL;種子培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL;分離培養(yǎng)基:干酪素5g，葡萄糖1g，酵母浸膏1g，磷酸氫二鉀4g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.1g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL;發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL。

752 紫外可見分光光度計 上海精密儀器廠;超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠;恒溫水浴鍋 余姚江南儀器廠;高壓滅菌鍋YX280B 上海三申醫(yī)療器械有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9075A 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱XMT-152C 重慶市永生實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離 取1 粒豆豉放入10mL 的生理鹽水中，在90℃水浴中加熱6min，使豆豉中的雜菌被殺死，將菌液用10 倍梯度稀釋法稀釋后涂布于酪素培養(yǎng)基上，36℃下培養(yǎng)24h，選擇能夠產(chǎn)生透明圈的菌落。共設(shè)3 組平行實驗。

1.2.2 菌種的初篩與復(fù)篩 將產(chǎn)生透明圈的菌株接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在36℃，170r/min 下振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)后的菌液進行梯度稀釋后接種到酪素培養(yǎng)基中，在36℃下培養(yǎng)24h，選擇透明圈直徑與菌落直徑的比值(HC 值)較大的菌落。

將初篩中透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中，在36℃，170r/min 下振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)好的菌液于有肉湯培養(yǎng)基的50mL 三角瓶中，36℃下振蕩培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速3500r/min 下離心30min，取上清液測定蛋白酶活力。

1.2.3 酶活力的測定 將復(fù)篩中選出的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株用福林酚法測定蛋白酶活力［5］，選出產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株進行鑒定。

1.2.4 菌種的鑒定 按照實驗的目的和要求進行菌種的初步鑒定。通過鏡檢觀察菌種的形態(tài)與菌落特征，并進行生理生化鑒定［6-7］，1%葡萄糖瓊脂、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、結(jié)晶糊精、苯丙氨酸、β-半乳糖苷酶、厭氧反應(yīng)、山梨醇、明膠、硫化氫、賴氨酸脫羧酶、硝酸鹽還原、尿素、蛋白胨水、石蕊牛奶等。

1.2.5 將篩選出的優(yōu)勢菌株制成單孢子懸液，取2mL 懸液到無菌培養(yǎng)皿中(同時制作7 份)，將培養(yǎng)皿放到磁力攪拌器上進行照射，磁力攪拌器離15W的紫外燈30cm，照射時間分別為0、60、120、180、240s。取0.1mL 照射后的菌液，涂布于平皿中，36℃下培養(yǎng)48h。觀察結(jié)果，按下式計算存活率與致死率［8］，并以時間為橫坐標、比活率(為存活率與致死率在不同誘變時間相對應(yīng)的百分比數(shù)值)繪制菌株誘變曲線，確定最佳誘變時間。

存活率(%)=(處理后1mL 菌液中活菌數(shù)/對照1mL 菌液中活菌數(shù))×100;

致死率(%)=(對照1mL 菌液中活菌數(shù)-處理后1mL 菌液中活菌數(shù))/對照1mL 菌液中活菌數(shù)×100。

1.2.6 優(yōu)良突變株的篩選 將誘變后的孢子懸液稀釋，涂布于酪素培養(yǎng)基，36℃避光培養(yǎng)24h，從中選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株進行點種，再從點種菌落中初篩出透明圈直徑與菌落直徑比值(HC 值)最大的菌落，接種培養(yǎng)進行復(fù)篩，做3 個平行，發(fā)酵48h 測定發(fā)酵液中的蛋白酶酶活［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離、初篩和復(fù)篩結(jié)果

通過菌種的分離從中篩選出30 株產(chǎn)生透明圈的菌株，將其接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上經(jīng)過初篩后得到16 株透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，然后再接種到培養(yǎng)基中進行復(fù)篩，最后得到8 株透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株進行酶活力測定。

2.2 菌種復(fù)篩產(chǎn)蛋白酶菌株活力測定

通過福林酚法測定復(fù)篩后得到的8 個菌株的產(chǎn)蛋白酶活力結(jié)果如圖1，得知菌株B 產(chǎn)生蛋白酶活力最高，為2360.80U/mL。

圖1 產(chǎn)蛋白酶活力Fig.1 Curve of enzyme activity of protease

2.3 菌種鑒定

鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，細胞形態(tài)呈桿狀、產(chǎn)生近中生橢圓狀芽孢。在營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶，有刺狀，有一層薄膜，菌落上有大量粘液;在酪素培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，邊緣整齊，白色，表面光滑;在肉湯培養(yǎng)基中長生薄膜，渾濁;生理生化結(jié)果見表1;根據(jù)實驗結(jié)果初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

表1 菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain

2.4 紫外誘變條件的選擇

結(jié)果顯示，菌株致死率隨誘變時間延長而增大，當誘變時間超過120s 時，致死率相應(yīng)上升，但存活率下降較大，由于低劑量處理能提高正突變率，負突變較多出現(xiàn)在偏高的劑量中，按照誘變后致死率在60%～70%時產(chǎn)生正突變的幾率最高［8］，從而由圖2知，誘變時間在120s 時，致死率為66.68%，因此誘變條件確定為距離15W 的紫外燈30cm，照射時間為120s。

2.5 優(yōu)良突變株的篩選結(jié)果

圖2 菌株紫外線誘變致死率曲線Fig.2 Curve of strain fatality rate after UV mutagenesis

菌株誘變后，在產(chǎn)生的44 個透明圈的菌株中，篩選出6 株透明圈直徑與菌落直徑比值(HC 值)較大的良突變株，測定酶活后得知B-14 號菌株酶活最高，酶活為2922.90U/mL，見圖3。

圖3 誘變后菌株產(chǎn)蛋白酶活力Fig.3 Curve of producing protease activity of the mutagenized strains

2.6 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性

檢測結(jié)果顯示，B-14 菌株經(jīng)5 次傳代，其蛋白酶活力變化范圍不超過10%，表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的產(chǎn)酶性能，表明菌株的遺傳性能良好，見表2。

表2 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性實驗Table 2 Genetic stability test of mutagenized strains

3 結(jié)論

本實驗對市售豆豉中篩選出的一株優(yōu)良地衣芽孢桿菌進行酶活力測定，并進行紫外誘變。篩選出的產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株B，酶活力為2360.80U/mL，用生理生化方法進行鑒定后得知此菌株為地衣芽孢桿菌，并對這個菌株進行紫外誘變處理，誘變條件為15W 的紫外燈下照射120s，與紫外燈的垂直距離為30cm，誘變后測定酶活，比較后得到的菌株B-14 為優(yōu)良菌株，酶活力為2922.90U/mL，連續(xù)傳代5 次的酶活力變化不超過10%，表明該突變菌株遺傳性穩(wěn)定，為后續(xù)實驗提供高效菌株。

在食品行業(yè)，蛋白質(zhì)深加工占據(jù)了很大比例，曾經(jīng)普遍使用的酸堿水解法因其存在食品安全和產(chǎn)品質(zhì)量差等原因，使其產(chǎn)品在應(yīng)用上受到很大的限制。隨著生物技術(shù)和生物工程的應(yīng)用和發(fā)展，以及純天然無毒害的酶法生產(chǎn)，因為其具有天然無毒、不含氯丙醇，生產(chǎn)條件溫和、成本低和產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點，在各大生產(chǎn)廠家得到了廣泛應(yīng)用，目前我國蛋白酶產(chǎn)量僅占生物酶總量的7%～8%，與國外發(fā)達國家的15%～20%蛋白酶比例相比，有較大差距，因此，作為廣譜性酶制劑，蛋白酶會有很大的市場發(fā)展空間。

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