曲映紅，劉志東，陳舜勝，*

(1.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090)

章魚胺(Octopamine，OA)，是脊椎動(dòng)物激素去甲腎上腺素的一個(gè)同類物，具有對(duì)-羥苯-β-羥乙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又名章魚涎胺或真硝胺，化學(xué)名為:1-(4-羥基苯基)-2-氨基乙醇，化學(xué)式為C8H11NO2，分子量為153.176。章魚胺首先由Espamer 和Boretti在章魚(Octopusvulgaris)的唾液中發(fā)現(xiàn)而得名［1］。章魚胺是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑［2］，在肥胖癥的治療和II 型糖尿病的防治上有潛在的應(yīng)用價(jià)值［3］。近來來，關(guān)于章魚胺的生物活性［4-5］和檢測方法［6-7］的研究日趨活躍。天然章魚胺也存在于枳實(shí)和魚露中，且魚露中的含量相對(duì)豐富［8］。在前期實(shí)驗(yàn)［9］中發(fā)現(xiàn)，利用智利外海莖柔魚內(nèi)臟釀制的魚露中章魚胺含量很高，可達(dá)6000 ～7000μg·mL-1。朱婷婷［10］研究發(fā)現(xiàn)H103 大孔吸附樹脂對(duì)魚露中章魚胺有較好的吸附分離效果，該樹脂對(duì)魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量達(dá)2.925mg·g-1(干樹脂)，用30%的乙醇作洗脫液，洗脫率達(dá)98.04%。王敏［11］用硅膠吸附分離魷魚內(nèi)臟水解液中的章魚胺，靜態(tài)飽和吸附量為3.209mg·g-1(干硅膠)，采用30%的乙醇為洗脫劑時(shí)，洗脫率達(dá)95.32%。由于H103 大孔吸附樹脂的處理過程中要使用鹽酸、丙酮、甲醇等試劑，因此從食品安全的角度考慮，本研究選用硅膠來分離提取魚露中的章魚胺。魚露中所含的章魚胺是具有較高生物活性的純天然章魚胺，本實(shí)驗(yàn)旨在探討從魚露中提取章魚胺的有效方法，以期為合理開發(fā)利用智利外海莖柔魚廢棄物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露 以莖柔魚內(nèi)臟為原料40℃保溫速釀的魚露。制備方法如下:莖柔魚內(nèi)臟切塊、絞碎，加入鹽(加入量為莖柔魚內(nèi)臟重量的20%)、水(料液比為1∶1)，攪勻裝桶，蓋上5 層紗布，40℃保溫釀制3 個(gè)月。魚露原漿較為粘稠，先用兩層脫脂紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得到澄清透明的魚露備用。章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品(鹽酸鹽) Sigma 公司;磷酸二氫鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、乙醇、硅膠(60～100 目，100～200 目和200～300 目) 分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站。

HWS12 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;層析柱;智能蠕動(dòng)泵;LGJ-10 臺(tái)式壓蓋型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;SCL-10A vp 高效液相色譜儀，SPD-10A vp 紫外檢測器，SIL-10ADvp 自動(dòng)進(jìn)樣器，CLASS-VP 工作站 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;Alliance 2695 Quattro micro 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 Waters 公司。

1.2 靜態(tài)吸附性能考察

1.2.1 飽和吸附量的測定 參考文獻(xiàn)［11］的方法。精密稱取60～100、100～200、200～300目三種規(guī)格的硅膠各約1g，分別置于50mL 的帶蓋塑料管中，準(zhǔn)確加入10mL 魚露，2h 內(nèi)每隔5min 震蕩10s，然后靜置24h，使硅膠達(dá)到飽和吸附。盡量不搖動(dòng)試管，使硅膠保持在試管底部，小心吸取上層溶液并測定章魚胺濃度。硅膠在室溫下的飽和吸附量按下式計(jì)算:飽和吸附量=(吸附前魚露中章魚胺濃度一吸附后魚露中章魚胺濃度)×魚露體積/硅膠干重。在其后的實(shí)驗(yàn)中選用吸附量最大的硅膠分離魚露中的章魚胺。

1.2.2 洗脫率的測定 參考文獻(xiàn)［10］的方法。從食品安全、經(jīng)濟(jì)角度及前期的研究結(jié)果綜合考慮，選用乙醇的水溶液作為洗脫劑。取7 支50mL 的帶蓋塑料管，分別加入精密稱取的硅膠(1.2.1 中吸附量最大的硅膠)約1g，準(zhǔn)確加入魚露5mL，每隔5min 震蕩10s，共2h，然后靜置24h，分離樹脂，對(duì)應(yīng)加入濃度分別為10%，20%，30%，40%，50%，70%，90%的乙醇水溶液各20mL，每隔5min 震蕩10s，共2h，測洗脫液濃度，計(jì)算洗脫率。洗脫率(%)計(jì)算公式為:洗脫率=(洗脫液濃度×洗脫液體積)/飽和吸附量×100。在其后的實(shí)驗(yàn)中選用洗脫率最大的乙醇溶液作為洗脫劑。

1.3 動(dòng)態(tài)吸附性能考察

1.3.1 動(dòng)態(tài)吸附 參考文獻(xiàn)［11］的方法。將1.2.1中靜態(tài)飽和吸附量最大的硅膠濕法裝柱，選用的層析柱直徑2cm，硅膠柱高度24cm，故柱體積約75mL。用智能蠕動(dòng)泵控制魚露以1BV·h-1的流速上柱。收集柱底流出的魚露，每50mL 取最后1mL，用HPLC法測定章魚胺含量。

1.3.2 動(dòng)態(tài)洗脫 參考文獻(xiàn)［12］的方法。達(dá)到飽和吸附的硅膠柱底以蠕動(dòng)泵抽5min，除去可能殘存的魚露，以前述靜態(tài)洗脫時(shí)洗脫率最大的乙醇溶液作為洗脫劑，用蠕動(dòng)泵控制其流速為1BV·h-1，收集洗出液，每5mL 一管，測定各收集管洗出液中章魚胺的濃度。

1.4 章魚胺的精制和定性鑒定

將收集的各管洗出液混合在一起，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10mL，采用島津SCL-10A vp HPLC 分離系統(tǒng)進(jìn)行精制，色譜條件為:采用Sepax HP-C18(21.2mm ×250mm，10μm)色譜柱，流動(dòng)相為0.02mol·L-1檸檬酸-0.02mol·L-1磷酸二氫鈉(7 ∶3)，pH3，流速10mL·min-1，檢測波長274nm。收集出峰時(shí)的流出液，真空冷凍干燥后用質(zhì)譜做定性鑒定。

將章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品和凍干后得到的白色粉末狀物質(zhì)分別配制成1ppm 的甲醇溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用高分辨率質(zhì)譜可得知離子的精確質(zhì)量數(shù)，然后以參照物作峰匹配可以確定分子式和分子量。使分子和離子中的各種化學(xué)鍵斷裂后可形成碎片離子，籍此可推斷出分子和離子的裂解方式，從而得到它們的結(jié)構(gòu)信息。本研究所采用的質(zhì)譜條件是:電噴霧離子源(ESI)，溫度120℃;脫溶劑氣和錐孔氣N2;脫溶劑氣流速500L h-1，脫溶劑溫度350℃;錐孔電壓20V，錐孔氣流速50L·h-1;毛細(xì)管電壓3.50kV;碰撞氣體氬氣;掃描方式為正離子掃描;碰撞能量分別為5、10、20eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠對(duì)魚露中章魚胺的靜態(tài)吸附

三種不同目數(shù)的硅膠對(duì)魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量如圖1 所示。結(jié)果表明:60～100、100～200、200～300目的硅膠對(duì)魚露中章魚胺的飽和吸附量分別為:3.8372、3.0429、1.6539mg·g-1(干硅膠)。可以看出，60～100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺的飽和吸附量明顯高于其他兩種硅膠，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用60～100目硅膠分離魚露中的章魚胺。

圖1 三種規(guī)格的硅膠對(duì)魚露中章魚胺靜態(tài)飽和吸附性能比較Fig.1 Comparison of statically saturated adsorption performance on the three kinds of silica gel

2.2 乙醇洗脫劑濃度的選擇

以乙醇水溶液為洗脫劑時(shí)測得的靜態(tài)洗脫率詳見表1。結(jié)果表明隨乙醇濃度的增加，章魚胺的洗脫率很快上升，以30%乙醇為洗脫劑時(shí)的洗脫率最高，達(dá)90.48%，之后隨濃度增大洗脫率降低。據(jù)此，在動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)就選用30%乙醇水溶液作為洗脫劑。

2.3 硅膠對(duì)魚露中章魚胺動(dòng)態(tài)吸附性能的研究

60～100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果見表2，當(dāng)60～100目硅膠處理的魚露為硅膠本身的2BV 時(shí)，即上樣魚露體積為150mL 時(shí)，上樣后魚露中的章魚胺濃度為1.546mg·mL-1;上樣魚露體積300mL(4BV)時(shí)，上樣后魚露中的章魚胺濃度為4.112mg·mL-1;發(fā)現(xiàn)在上樣量在300～350mL 時(shí)，上樣后魚露中的章魚胺濃度已接近上樣前濃度，可認(rèn)為硅膠對(duì)章魚胺的吸附已接近飽和，故認(rèn)為60～100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺動(dòng)態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV。

表1 洗脫劑的不同濃度對(duì)洗脫率的影響Table 1 Effect of different eluent concentration on the elution rate

表2 60～100目硅膠對(duì)章魚胺的動(dòng)態(tài)吸附效果Table 2 Dynamic adsorption capacity of 60～100mesh silica gel for octopamine

2.4 硅膠對(duì)魚露中章魚胺的動(dòng)態(tài)洗脫

以洗出液體積為橫坐標(biāo)，以洗出液中章魚胺濃度為縱坐標(biāo)作圖可說明洗脫液(30%的乙醇溶液)對(duì)硅膠柱上章魚胺的動(dòng)態(tài)洗脫情況，如圖2 所示。從圖中可以看出，洗出液體積達(dá)到40mL 時(shí)，洗出液中章魚胺濃度達(dá)到最大值，并隨洗脫液體積的增加而逐漸下降，到75mL 時(shí)洗出液中的章魚胺濃度已降至0.5mg·mL-1以下，這時(shí)可以認(rèn)為硅膠柱上吸附的章魚胺已基本上被洗脫下來，此時(shí)洗脫液上樣量為82.5mL，即1.1BV。

圖2 硅膠對(duì)章魚胺的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.2 Dynamic desorption curve of silica gel for octopamine

2.5 精制凍干后章魚胺的質(zhì)譜分析

章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品和提取得到的章魚胺凍干樣品分別被不同的碰撞能量轟擊，得到的質(zhì)譜圖如圖3 和圖4 所示，其中圖3a～圖3c 分別為碰撞能量為20、10、5eV 時(shí)章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖，圖4a～圖4c 分別為碰撞能量為20、10、5eV 時(shí)章魚胺凍干樣品的質(zhì)譜圖。由圖中可以看到章魚胺凍干品與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖基本一致，因此可認(rèn)為凍干后得到的物質(zhì)為純度較高的章魚胺。

圖3 章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of octopamine standard

圖4 章魚胺樣品質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of octopamine sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用智利外海莖柔魚內(nèi)臟為原料，經(jīng)保溫速釀制備魚露，再經(jīng)硅膠柱吸附、乙醇洗脫、高效液相色譜精制并凍干后，得到了較高濃度的天然章魚胺粉末。本研究發(fā)現(xiàn)60～100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量達(dá)3.837mg·g-1(干硅膠)，以30%的乙醇為洗脫劑時(shí)，洗脫率達(dá)90.48%。60～100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺動(dòng)態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV，動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)用1.1BV 洗脫液可基本洗脫完全。

魚露中章魚胺的含量較為豐富，高于其他許多水產(chǎn)品。從魚露中有效提取章魚胺并進(jìn)行精制，可以為進(jìn)一步開發(fā)利用天然章魚胺打下基礎(chǔ)。從智利外海莖柔魚內(nèi)臟速釀魚露中提取章魚胺，可使廢棄物得以綜合利用，減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。實(shí)驗(yàn)過程中所用硅膠、洗脫劑等安全無毒，可為制備食用級(jí)的章魚胺產(chǎn)品提供依據(jù)。

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