王瑞康

華盛頓大學(xué) 生物工程系，華盛頓 西雅圖 98195

在體組織微循環(huán)的無(wú)標(biāo)記光學(xué)微血管造影

王瑞康

華盛頓大學(xué) 生物工程系，華盛頓 西雅圖 98195

欄目主編：王瑞康

王瑞康，美國(guó)華盛頓大學(xué) (西雅圖 )生物工程系和眼科學(xué)系終身教授，博士導(dǎo)師。出生于江蘇省溧陽(yáng)市，攻讀于天津大學(xué)精密儀器工程系，獲工學(xué)學(xué)士和碩士學(xué)位。1995 年在英國(guó)格拉斯哥大學(xué)（University of Glasgow）取得博士學(xué)位并進(jìn)行兩年博士后研究，隨后先后擔(dān)任基爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院（Keele Medical School）生物成像科學(xué)講師和高級(jí)講師。2002 年，作為英國(guó)克蘭菲爾德大學(xué)（Cranfield University）生物醫(yī)學(xué)光學(xué)首席教授 (是年 36 歲 )，創(chuàng)立了生物光子成像實(shí)驗(yàn)室。2005 年被聘為美國(guó)俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)（Oregon Health and Science University）醫(yī)學(xué)工程和麻醉學(xué)系終身教授并在該大學(xué)指導(dǎo)運(yùn)作生物光子成像實(shí)驗(yàn)室。2010 年他將實(shí)驗(yàn)室搬遷到美國(guó)生命科學(xué)研究活躍地區(qū)——西雅圖市并擔(dān)任華盛頓大學(xué)（University of Washington）生物工程系和眼科學(xué)系教授。作為全球生物光子成像和光學(xué)相干成像技術(shù)的領(lǐng)銜人物，他相繼在權(quán)威性刊物發(fā)表論文 200 多篇，編寫(xiě)了光學(xué)醫(yī)學(xué)成像和光學(xué)信息處理專題著作 2篇，并撰寫(xiě)系列書(shū)籍 12 章節(jié)。現(xiàn)為美國(guó)光學(xué)學(xué)會(huì) (OSA)資深會(huì)員 (Fellow)、國(guó)際光子光學(xué)學(xué)會(huì) (SPIE)資深會(huì)員 (Fellow)和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 (NIH)生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)特許評(píng)審員 (chartered member)。現(xiàn)任 Journal of Biomedical Optics及Biomedical Optics Express 等知名權(quán)威期刊的副編輯。主要研究方向包括生物光子成像、光學(xué)相干成像、微血管成像、光聲成像，以及成像技術(shù)在神經(jīng)學(xué)、眼科學(xué)、皮膚學(xué)和癌癥中的應(yīng)用。

很多生物組織的病理及血管形態(tài)與組織微循環(huán)的改變密切相關(guān)。光學(xué)相干斷層成像（OCT）是一種能以微米分辨率無(wú)創(chuàng)獲取生物結(jié)構(gòu)三維圖像的成像技術(shù)。光學(xué)微血管造影（OMAG）則是對(duì)OCT數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織血管形態(tài)的三維可視化方法。OMAG具有很高的空間分辨率，能觀察到單根毛細(xì)血管，并且不需要使用造影劑，其圖像襯比度是基于血管內(nèi)運(yùn)動(dòng)的血細(xì)胞后向散射產(chǎn)生的內(nèi)源光信號(hào)。本文簡(jiǎn)要回顧了OMAG技術(shù)的理論，并介紹了該技術(shù)以毛細(xì)血管分辨率在活體組織如腦、皮膚、和視網(wǎng)膜內(nèi)的動(dòng)態(tài)血流灌注成像中的應(yīng)用。

傅立葉域光學(xué)相干斷層成像; 光學(xué)微血管造影；光學(xué)成像技術(shù)；活體組織成像；生物醫(yī)學(xué)儀器

0 前言

在不使用造影劑的情況下，能夠?qū)δ苄匝埽ò?xì)血管）進(jìn)行無(wú)損成像，并對(duì)其血流進(jìn)行量化分析，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷以及與血管相關(guān)的疾病治療具有重要價(jià)值。當(dāng)前的成像方法存在一些局限性，包括有創(chuàng)（如放射線測(cè)量方法）、無(wú)法提供三維（3D）信息（如激光散斑襯比度成像）、空間和時(shí)間分辨率低（如核磁共振成像）或成像深度有限（如多光子顯微鏡，其成像深度 ＜300 μm）。因此，研發(fā)出一種具有較高分辨率（＜10 μm），能夠無(wú)創(chuàng)獲取在體組織三維血流灌注的無(wú)標(biāo)記成像方法具有重大的科研和臨床意義。

光 學(xué) 相 干 斷 層 成 像（Optical Coherence Tomography，OCT）[1-2]是 一 種 能 以 微 米 分 辨 率 實(shí) 現(xiàn) 對(duì)三維生物組織結(jié)構(gòu)可視化的成像方法，其成像深度高達(dá) 1～3 mm。經(jīng)過(guò)研究人員的不懈努力，OCT技術(shù)已能從組織的微結(jié)構(gòu)中分離出血管，如相位分辨光學(xué)多普勒斷層掃描（Phase Resolved Optical Doppler Tomography，PRODT）[3]，該方法主要基于比較OCT信號(hào)一個(gè)B-掃描內(nèi)的相鄰A-掃描之間的相位差，該相位差與血流速度有直接關(guān)系。雖然目前 PRODT 已被廣泛使用，但由于其對(duì)血流的靈敏度較低，很難清楚地觀察到流速為 0.1～0.9 mm/s[4]或者流速更低的疾病狀態(tài)下的毛細(xì)血管。為了提高其靈敏度，研究人員已提出了一些改進(jìn)方法，例如利用前向和后向 B- 掃描[5]，及利用相鄰的 B- 掃描之間的相位方差[6]。由于相鄰的 B- 掃描之間的時(shí)間間隔相對(duì)較長(zhǎng)（ms量級(jí)），使得該方法能夠?qū)碛芯徛鞯拿?xì)血管進(jìn)行成像。但是，該方法需要較長(zhǎng)的采集時(shí)間（25 min），并且對(duì)物體運(yùn)動(dòng)偽影非常敏感。研究人員還提出了一些其他方法，如諧振多普勒血流成像[7]、時(shí)頻域聯(lián)合成像[8]、散班方差成像[9]、相位方差襯比成像[10]、以及單次通過(guò)血流成像[11]。

光學(xué)微血管造影（Optical Microangiography，OMAG）[12-16]是一種能夠在體對(duì)微循環(huán)床內(nèi)的毛細(xì)血管成像的方法。通過(guò)對(duì)組織內(nèi)靜態(tài)散射信號(hào)和動(dòng)態(tài)散射信號(hào)的有效分離，可獲取毛細(xì)血管動(dòng)態(tài)血液灌注的三維分布。OMAG 技術(shù)最初曾嘗試?yán)萌珗?chǎng)復(fù)傅立葉域 OCT 的方法[17-18]，但后來(lái)，研究人員提出了多種方法從強(qiáng)散射背景中有效地提取血流信號(hào)，提高了系統(tǒng)對(duì)血流的靈敏度。其成像襯比度源于內(nèi)源性運(yùn)動(dòng)粒子（如流動(dòng)的血細(xì)胞）的后向散射光，因而無(wú)需使用外源的造影劑。到目前為止，OMAG 已被用于分析兩個(gè)相鄰的 A-掃描和兩個(gè)相鄰的 B-掃描之間的相位差。在本文中，我們主要介紹了 OMAG 的系統(tǒng)構(gòu)成，并介紹了OMAG在在體生物組織研究中的一些應(yīng)用。

1 OMAG理論概述

OMAG 是 傅 立 葉 域 OCT（Fourier Domain Optical Coherence Tomography，F(xiàn)DOCT） 的 一 種 擴(kuò) 展 形 式， 能 夠同時(shí)獲得被掃描的組織樣本的三維微結(jié)構(gòu)和微血管圖像。OMAG 采用的光譜域 OCT 系統(tǒng)（FDOCT 的一種形式）的示意圖如圖 1（A）所示。該系統(tǒng)的詳細(xì)介紹參見(jiàn)文獻(xiàn) [17]。簡(jiǎn)要地講，該系統(tǒng)采用超發(fā)光二極管或超連續(xù)光作為光源。樣品光被耦合到光纖探頭，該探頭由X-Y掃描振鏡和光學(xué)系統(tǒng)組成，光學(xué)系統(tǒng)用來(lái)探測(cè)待觀察樣品的往返光。系統(tǒng)的橫向分辨率由物鏡確定，而軸向分辨率則由光源的中心波長(zhǎng)決定，并與其帶寬成反比。系統(tǒng)的分辨率通常為～ 10 μm。從參考臂和樣品臂返回的光信號(hào)重新聚到一起并傳送到由計(jì)算機(jī)控制的光譜儀，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和處理。

圖1 （A）有光纖來(lái)實(shí)現(xiàn)的OMAG/OCT系統(tǒng)示意圖。（B）掃描成像示意圖。

對(duì)每個(gè)位置采集一條A線（深度方向）。不同橫向位置的幾條A線組合起來(lái)稱為一幀B-掃描，而不同位置的幾幀 B- 掃 描則形成 C- 掃 描 或 三 維數(shù)據(jù)集， 如 圖 1（B）所示。

OMAG 的工作原理是基于對(duì)光譜儀采集到的光譜干涉信號(hào)的分析，如公式 (1)所示 ：

其中，k是波數(shù)，t是采集一條 A 線的時(shí)間，ER 是從參考鏡反射回來(lái)的光強(qiáng)，S（k）是所用光源的頻譜密度，n是組織的折射率，z是深度坐標(biāo)，a（z，t）是后向散射光的幅度，v為位于深度z1處的血管內(nèi)血細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度?？紤]到來(lái)自于樣品的后向散射光相對(duì)于來(lái)自于參考鏡反射的光要微弱得多，我們可以忽略樣品內(nèi)從不同位置散射的光信號(hào)之間的自相關(guān)、互相關(guān)。同時(shí)，直流信號(hào)對(duì)OMAG信號(hào)沒(méi)有貢獻(xiàn)，因此，也不予考慮。接著，應(yīng)用一個(gè)基于差分運(yùn)算的高通濾波器，其運(yùn)算公式如公式 (2)：

其中，i表示A 線或B-掃描的索引。該濾波器能針對(duì)較快流速或較慢流速，分別用于B-掃描或C-掃描方向。同樣，公式 (2)也適用于時(shí)域信號(hào)（例如 OCT 信號(hào)）。已有研究表明，多普勒 OMAG也可對(duì)微循環(huán)組織床的功能性血管的血液流速進(jìn)行在體定量分析。該方法同時(shí)利用了OMAG和相位分辨方法的優(yōu)點(diǎn)，并引入了通過(guò)數(shù)字重建實(shí)現(xiàn) 對(duì) 組 織 背 景 光 學(xué) 性 質(zhì) 均 勻 化 的 方 法[19]。 血 液 流 速 取 決于兩條 A 線之間的時(shí)間間隔 (Δtb)，可通過(guò)公式 (3)計(jì)算 ：

其中，λ是光波長(zhǎng)，Δφ是兩條A線之間的相位差，n是樣品的折射率。實(shí)驗(yàn)表明，OMAG在快速掃描（B-掃描）方向?qū)α魉俚撵`敏度可達(dá) 160 μm/s[19]，慢速掃描（C- 掃描）或 M- 模式掃描（重復(fù)掃描）方向的靈敏度為 4μm/s[20]。

2 OMAG的應(yīng)用

OMAG 能夠在體實(shí)現(xiàn)對(duì)人體及動(dòng)物組織中單根毛細(xì)管三維血管形態(tài)的定量分析，對(duì)于我們了解一些疾病的機(jī)理是非常有價(jià)值的。在過(guò)去的研究中，OMAG 已被用于在體監(jiān)測(cè)生物組織的微血管造影，包括小鼠耳朵[21]、人眼視網(wǎng)膜[22]、大鼠視網(wǎng)膜[23]、人體角膜 - 鞏膜邊緣[24]、小鼠顱內(nèi)腦血管灌注[25]、沙鼠耳蝸[26]、小鼠耳蝸[27]、小鼠腎臟內(nèi)微循環(huán)[28]、正常人體皮膚和銀屑病的皮膚內(nèi)血管[29]、小鼠腓腸肌[30]等。同時(shí)，也有研究考察了 OMAG 技術(shù)的重復(fù)性，并提出了根據(jù)血管長(zhǎng)度分布、血管區(qū)域密度和分形維數(shù)對(duì)圖像進(jìn)行量化的方法[31]。

圖2 無(wú)需造影劑的OMAG/OCT對(duì)人的眼底血流分布進(jìn)行無(wú)損成像。（A）OCT生成的眼底圖，尺寸=10 mm×10 mm；（B）OMAG生成的眼底血流分布圖，尺寸=8 mm×9 mm。圖（B）相對(duì)應(yīng)于圖（A）中的方框位置。

OCT/OMAG 最大的優(yōu)點(diǎn)是可以在無(wú)需使用外源造影劑的情況下對(duì)組織的血流分布進(jìn)行無(wú)損成像。因?yàn)?OCT/ OMAG 是一種基于光學(xué)成像的技術(shù)，所以它最適用于對(duì)人眼進(jìn)行成像。當(dāng)今 OCT/OMAG 的成像速度已能達(dá)到每秒得到 500,000 條 A- 線。這種速度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)人體眼底進(jìn)行三維成像，并且能減少由于眼睛運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的偽影。圖 2（A）是用每秒500,000條A- 線的系統(tǒng)掃描成的OCT 人眼眼底圖。經(jīng)過(guò)對(duì) 3-DOCT 數(shù)據(jù)的 OMAG 處理，就可得到眼底的血流分布圖，圖 2（B）給出了 OMAG 血流分布圖。不需要用造影劑，OMAG 就能無(wú)損地呈現(xiàn)出人體眼底詳細(xì)的血流分布情況，這對(duì)提高眼科相關(guān)疾病的診斷和治療具有重大的醫(yī)學(xué)意義。這些疾病涵蓋了由糖尿病引起的眼睛病變、青光眼以及老年視力減緩癥等。

圖3 OMAG對(duì)人手指表層毛細(xì)管血流分布進(jìn)行成像。（A）手指成像示意圖；（B）相應(yīng)位置的毛細(xì)管血流分布圖，尺寸=2 mm×2 mm。

圖 3給出了人手指背面血管的 3D 投影視圖。從圖中，我們可以觀察到手指的血管結(jié)構(gòu)（例如長(zhǎng)度、直徑、密度和曲率）與人眼視網(wǎng)膜血管有著顯著的區(qū)別。血管的前端呈現(xiàn)出正常皮膚的典型循環(huán)結(jié)構(gòu)（如圖 3 中箭頭所示）[32]。這些關(guān)于指端微血管的結(jié)構(gòu)及血流情況的研究，可以輔助醫(yī)生對(duì)結(jié)締組織疾病、雷諾氏病以及糖尿病等疾病做出更加準(zhǔn)確的診斷。

圖 4給出了使用 OMAG 技術(shù)獲得的小鼠耳部血管的投影 視 圖。小鼠耳 朵 是 研 究 燒傷[21]及 腫 瘤[33]引 起 的 血 流變化的重要模型。如圖中所示，OMAG可以清晰地顯示出小鼠耳部的各級(jí)血管包括毛細(xì)血管網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過(guò)后期的圖像處理及分析，我們還可以提取出血管直徑、血管密度、血流方向及血流速度等重要信息。這對(duì)研究傷口愈合、血管生成等生理過(guò)程具有重要意義。

圖4 OMAG對(duì)皮膚表層毛細(xì)管血流分布進(jìn)行成像。圖示為小鼠耳部的詳細(xì)血流分布圖。尺寸= 10 mm×9 mm。

圖5 給出了小鼠大腦在完整頭骨下的血管投影視圖。小鼠大腦是一個(gè)很好的模型，可用于研究中腦動(dòng)脈堵塞和腦外傷導(dǎo)致的腦中風(fēng)以及藥物對(duì)腦血流的影響。

圖5 OMAG對(duì)活體小鼠大腦血流分布進(jìn)行成像，并且成像不需要對(duì)腦骨進(jìn)行處理。只要一次3D掃描，OMAG就可同時(shí)給出小鼠（A）腦骨中和（B）大腦皮層的詳細(xì)血流分布圖。尺寸=10 mm×10 mm。

3 結(jié)論

OMAG 是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)標(biāo)記的成像方法，可以獲得組織血管的三維血管造影，并能分辨到毛細(xì)血管層。該技術(shù)利用了傅立葉域 OCT干涉信號(hào)中的散射光信號(hào)特性，來(lái)分離血流灌注血管。雖然本文突出了該方法無(wú)需使用標(biāo)記物，但使用造影劑（如納米顆粒和微泡）很可能會(huì)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)元素的后向散射光信號(hào)，從而進(jìn)一步提高 OMAG 的成像質(zhì)量。OMAG 能夠獲得深度為幾毫米的圖像，具有較高的空間和時(shí)間分辨率。到目前為止，該成像技術(shù)已在在體生物組織，如腦、耳、視網(wǎng)膜、耳蝸及皮膚等方面得到了廣泛的應(yīng)用。對(duì)組織血管造影的研究將極大的幫助人們加深對(duì)一些疾病病理學(xué)（如血管生成、與年齡有關(guān)的黃斑變性）的理解，以及對(duì)新藥物的開(kāi)發(fā)和研制（如，促進(jìn)傷口愈合的藥物）等。

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Label Free Optical Microangiography of Tissue Microcirculations in Vivo

Ruikang K Wang
Department of Bioengineering, University of Washington, Seattle, Washington 98195, USA.

Pathologies and vascular forms of most biological tissues are closely associated with the changes of tissue microcirculations. Optical coherence tomography (OCT) is an imaging technique capable of providing non-invasive three-dimensional (3D) images of tissue microstructure with cellular level resolution. As a recent technological extension to OCT, optical microangiography (OMAG) is a volumetric imaging technique that is capable of producing 3D images of dynamic blood perfusion within microcirculatory tissue beds in vivo. OMAG is of high spatial resolution that is sufficient to delineate single capillary vessels, and does not require the use of contrast agents. The OMAG imaging contrast is based on the intrinsic optical scattering signals backscattered by moving blood cells in patent blood vessels. In this paper, I will first provide a brief review of the OMAG theory, and then present some examples of using OMAG to delineate the dynamic blood perfusion, down to capillary level resolution, within living tissues, including brain, skin, and retina.

Fourier domain optical coherence tomography; optical microangiography; optical imaging; in vivo imaging; bioinstrumentation

TH773；R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2013.11.001

1674-1633(2013)11-0001-04

2013-10-10

2013-10-29

作者郵箱：wangrk@uw．edu