李偉，牛慶，李霞蓮，沈飛霞，施紅英，曹淑彥，張婷，李春梅，呂建新

（溫州醫(yī)學院，浙江 溫州 325035，1.檢驗醫(yī)學院、生命科學學院 檢驗醫(yī)學教育部重點實驗室；2.附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科；3.環(huán)境與公共衛(wèi)生學院；4.附屬第二醫(yī)院 科研中心）

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會數(shù)據(jù)顯示，2011年全球約有3.66億糖尿病患者，預計到2030年將增長到5.52億[1]，其中2型糖尿病（T2DM）占90%～95%。2007年6月至2008年5月，在中國成年人中進行的一次大規(guī)模調(diào)研顯示，T2DM和糖耐量異常人數(shù)分別約為9240萬和1.48億，且以中青年人為主，居世界第一位[2]。因此，對T2DM防治已是刻不容緩。T2DM是由胰島素抵抗和胰島β細胞功能失調(diào)引起的一種多基因遺傳性疾病，遺傳因素和生活環(huán)境因素相互作用被公認為是該病形成的主要機制。因此，易感人群的篩查和早期生活方式的干預是預防T2DM發(fā)生發(fā)展的有效措施。

從2007年迄今，通過采用全基因組關聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）技術，已報道約40個基因與T2DM密切相關[3]，其中包括CDKAL1（CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1）。該基因在不同種族和人群中得到反復驗證，是公認的易感基因之一[4]，位于人類染色體6p22.3，可以編碼一種tRNA修飾酶-甲硫基轉(zhuǎn)移酶，主要負責tRNALys（UUU）37位堿基的2-甲硫基-N6-蘇氨酸氨基甲酰腺苷酸（2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine，ms2t6A）合成[5]。在β細胞特異性CDKAL1基因敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)胰島β細胞線粒體ATP生成障礙和第一時相胰島素分泌受損[6]。2007年冰島人群的GWAS研究首次報道了rs7756992位點與T2DM關聯(lián)[7]，后來在多個研究中，特別是在亞洲人群中得到重復驗證[8]。因此，該基因多態(tài)性位點的基因型分析在確定T2DM易感人群中具有重要意義。

由于T2DM遺傳的高度異質(zhì)性，在不同民族和不同人群中易感基因的檢測及其作用仍需要進行重復驗證。本研究采用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）和DNA測序技術，建立基因分型的技術平臺，對rs7756992位點與中國漢族人群T2DM的關聯(lián)性進行驗證，并進一步分析不同基因型的臨床特征，為該病分子分型建立初步基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象 病例組來自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科住院部2009年3月至2010年10月期間被診斷為T2DM的患者，共534例；對照組人群由2009年12月至2010年1月期間于溫州市體檢中心進行體檢的健康體檢者篩選所得，共453例，所有入選者均為浙江省溫州地區(qū)漢族人群。T2DM診斷根據(jù)1997年WHO糖尿病診斷標準，且排除：①其他內(nèi)分泌及代謝性疾病患者，如甲狀腺功能亢進和減低、原發(fā)性醛固酮增多癥等；②惡性腫瘤和非高血壓引起的嚴重心、肝、腎等慢性疾病患者；③藥物等因素引起的糖、脂代謝異常者；④風濕免疫性疾病患者；⑤不合作或資料不全者。對照組人群的篩選標準為：空腹血糖（FBG）＜5.6 mmol/L的非糖尿病體檢者，且既往無糖尿病病史及家族史。該研究經(jīng)溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽署知情同意書。

1.2 生化指標測定與樣本DNA提取 所有研究對象采集空腹外周靜脈血2 mL，用于基因組DNA提取及各項生化指標測定。使用DNA提取試劑盒（大連寶生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，D824A）及磁珠提取法（深圳易瑞生物技術有限公司的800μL全血基因組DNA磁珠提取試劑盒）對收集的病例組和對照組樣本進行全基因組DNA提取，用NanoDrop 2000分光光度計測定其濃度和純度后，保存在-30 ℃冰箱中。

1.3 HRM基因型分類

1.3.1 引物：HRM對引物自身結(jié)構和特異性要求較高，PCR擴增長度以60～150 bp最佳，且擴增片段越短，基因型分類越容易。本實驗所采用的引物由Primer 5設計，并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物上游序列為5’-CCATTAATATTC CCCCCTGT-3’，下游序列為5’-GAGCTTCATGCAACCAAG AG-3’，擴增片段長度124 bp。

1.3.2 PCR擴增和HRM條件：使用Light Cycler 480 SystemII（德國羅氏公司）對所有樣本全基因組DNA進行PCR擴增和HRM分析，實驗所用試劑LightCycle480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司。

首先使用設計好的HRM專用引物做普通PCR，獲得引物的最佳退火溫度。然后隨機選取5～10個樣本進行HRM分析，得到最優(yōu)標準化溫度（71～72 ℃和80～81 ℃），并根據(jù)熔解曲線形狀和顏色區(qū)分樣本基因型。

本實驗在96孔板中進行。HRM優(yōu)化后的擴增體系為：HRM Master 5μL， MgCl21μL（2.5 mmol/L），上下游引物各0.5μL（0.5μmol/L），全基因組DNA 1μL（約10～25 ng）和一定量的去離子水（調(diào)節(jié)最終反應體積至10μL）。HRM反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，最后72 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束，產(chǎn)物于95 ℃加熱1 min后降至40 ℃，然后又以1℃/s的速度從65 ℃加熱至95 ℃，最后在40 ℃條件下冷卻10 s。實驗結(jié)果可視化熒光數(shù)據(jù)有標準圖、溫度變化圖和差異圖三種，使用LightCycle480 Gene scanning軟件自動化分組功能進行分析。

1.3.3 假陽性和假陰性結(jié)果排除：由于HRM技術會出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，我們設陽性對照和陰性對照。另外對一些結(jié)果不可信的樣本進行重復上機，并隨機抽取各20例病例組和對照組樣本用DNA直接測序技術進行驗證。

1.4 DNA直接測序 DNA測序技術可以對變異進行定位和鑒定，是目前基因分型技術中檢測基因突變和單核苷酸多態(tài)性的金標準。本研究通過該技術，測定HRM熔解曲線中不同顏色和形狀的曲線所代表的基因型，并對隨機抽取的少量樣本進行驗證。我們通過PCR技術擴增CDKAL1基因中包含rs7756992位點的DNA片段，擴增片段經(jīng)過純化后直接用于測序分析。PCR擴增用引物，上游為5’-TCTGATTTTCTCA CCCTACAC-3’，下游為5’-CCTGGGAGAATTTACTTGG-3’，由Primer 5設計，北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR擴增體系（25μL）包括：去離子水18μL，dNTP 2μL，Buffer 2μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.2μL（10μmol/L），Taq酶0.1μL（大連寶生物公司Takara PCR反應體系）。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，其中變性、退火和延伸分別擴增35個循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物的純化和測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 臨床資料分析中呈正態(tài)分布的計量資料用±s表示，使用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（四分位間距）表示，經(jīng)變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后再做獨立樣本t檢驗，而變量變換后未轉(zhuǎn)為正態(tài)的非正態(tài)分布資料用秩和檢驗，計數(shù)資料使用x2檢驗。群體基因型和等位基因頻率均經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性。rs7756992基因型和等位基因與T2DM發(fā)病風險和糖尿病并發(fā)癥關聯(lián)分析使用x2檢驗。T2DM患者不同基因型與臨床特征比較，呈正態(tài)分布的計量資料用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），非正態(tài)分布資料經(jīng)對數(shù)變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后用ANOVA，計數(shù)資料用x2檢驗，然后對于有統(tǒng)計學意義的指標，使用多元線性回歸進行校正。所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對照組的臨床特征及生化指標比較 病例組和對照組臨床資料及各項生化指標統(tǒng)計情況見表1。病例組人群年齡、BMI、血壓、FBG和血清甘油三酯（TG）較對照組顯著增高（P＜0.05），尤其是BMI、血壓、FBG和TG差異更為明顯（P＜0.01）。對照組人群血清總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）顯著高于病例組（P＜0.01），而性別分布在兩組人群中無明顯差異（P＞0.05）。

表1 病例組和對照組人群臨床基本特征（±s）

表1 病例組和對照組人群臨床基本特征（±s）

注：*表示非正態(tài)分布資料，變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后使用獨立樣本t檢驗；#表示變量變換后未轉(zhuǎn)為正態(tài)資料，使用秩和檢驗

臨床特征例數(shù)年齡（年）性別（男/女）BMI（kg/m2）血壓收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）TC（mmol/L）*TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*FBG（mmol/L）#534 61.03±12.65 280/254 24.25±3.38 453 58.82±11.39 229/222 22.31±2.19＜0.05＞0.05＜0.01 143.24±24.8 80.47±11.68 4.36（1.46）1.29（0.98）1.11（0.42）8.05（4.10）119.12±11.48 74.65±8.24 4.73（1.02）1.00（0.51）1.36（0.45）5.02（0.81）＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 P病例組 對照組

2.2 基因型和等位基因檢測及分析

2.2.1 HRM分析：圖1A為rs7756992的標準熔解曲線，圖1B為標準化的溫度變化曲線，隨著溫度的改變，代表不同基因型的熔解曲線形狀和顏色發(fā)生改變。其中綠色表示突變型GG，紅色表示野生型AA，而藍色則表示雜合子AG。

圖1 高分辨率熔解曲線（HRM）

2.2.2 DNA直接測序結(jié)果分析：DNA測序結(jié)果使用Condon code Aligner軟件與NCBI中提供的人類CDKAL1基因標準序列（GenBank#：NC_000006.11）進行比對分析，查找發(fā)生核苷酸變異的位點（見圖2）。經(jīng)驗證，在隨機抽取的40例樣本中兩種實驗方法的重復率達到100%。

圖2 rs7756992位點DNA測序結(jié)果

表2 rs7756992位點各基因型和等位基因頻率分布

2.3 等位基因及基因型分析 病例-對照組人群進行Hardy Weinberg檢驗，多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率在病例組和對照組中均達到遺傳平衡，具有群體代表性。

我們將CDKAL1基因rs7756992位點基因型頻率分布按照G/A，GG/AA，（GG+AG）/AA，GG/（AG+AA）四種模型進行分析（見表2），可以看出：在病例組和對照組間，基因型GG所占比重較AA型大，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.048，OR=1.43，95%CI＝1.00～2.03），而且等位基因G對T2DM也存在一定影響（P＝0.045，OR=1.12，95% CI＝1.00～1.43）。

2.4 基因型與臨床特征分析 按照不同基因型AA、AG和GG將T2DM患者分為三組，對每組的臨床特征及生化指標進行比較。從表3中可以看出：GG基因型患者發(fā)病年齡較AA型低，三種基因型間差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.02），但是經(jīng)過性別和年齡校正后，差異不再有統(tǒng)計學意義；AA和AG基因型患者的FBG濃度較GG型增高，三者間有顯著差異（P＝0.03），經(jīng)過性別和年齡校正后，差異仍然顯著（P＜0.01），但是三組之間HbA1c未見顯著差異。另外，不同基因型患者之間血壓、BMI和血脂差異無統(tǒng)計學意義，但通過對這3個參數(shù)按照臨床標準進行等級劃分后發(fā)現(xiàn)，在肥胖和TC異?；颊咧蠫G基因型所占比重最大。

2.5 等位基因及基因型與T2DM并發(fā)癥關聯(lián)分析 將534例T2DM患者按照糖尿病并發(fā)癥類型進行分組（劃分標準是根據(jù)臨床診斷和相關輔助檢查，如血管B超、視網(wǎng)膜檢查、神經(jīng)肌電圖檢查、肝腎功能檢查和血壓測量等），觀察基因型和等位基因頻率在各種慢性并發(fā)癥中的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者間無顯著關聯(lián)（見表4）。

3 討論

2007 年，在冰島人群的病例-對照研究中，首次發(fā)現(xiàn)rs7756992（G）與T2DM關聯(lián)，而且這一結(jié)果在丹麥、歐洲祖先人群以及中國香港漢族人群中得到驗證[7]。隨后，在多項研究中也證實了這一位點與亞洲人群T2DM存在關聯(lián)，G為風險等位基因（OR＝1.19）[8]。在最近的中國大陸漢族人群研究中，也已得到驗證（OR＝1.21）[13]。在本研究中，我們進行了CDKAL1基因rs7756992位點與T2DM的關聯(lián)分析，驗證了在浙江省溫州地區(qū)漢族人群中，rs7756992（G）為T2DM風險等位基因（P＝0.045），這一結(jié)果與文獻報道相吻合，說明該位點與中國漢族人群T2DM緊密關聯(lián)。同時，我們觀察到GG基因型與AA基因型相比差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.048），GG基因型在T2DM人群中頻率增高，這一頻率分布與文獻[14]報道的數(shù)據(jù)基本一致。

表3 病例組不同基因型患者臨床特征比較（±s）

表3 病例組不同基因型患者臨床特征比較（±s）

注：*表示非正態(tài)分布資料；a表示用多元線性回歸，經(jīng)性別和年齡校正后；△BMI正常范圍：18.5≤BMI＜24，過重：24≤BMI＜27，肥胖≥27；▲TC＞6.0 mmol/L為異常

P 0.28 0.06 0.02（0.88a）0.76 0.59 0.03（＜0.01a）0.71 0.69 0.11 0.37 0.84 0.38基因型例數(shù)（%）年齡（年）性別（男/女）BMI（kg/m2）△正常[例數(shù)（%）]過重肥胖血壓收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）發(fā)病年齡（年）胰島素治療（有/無）家族史（有/無）FBG（mmol/L）*HbA1c（%）TC（mmol/L）*▲＞正常[例數(shù)（%）]TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*LDL（mmol/L）*AA 114（21.35）59.69±12.77 67/47 24.08±2.98 55（48.25）41（35.96）18（15.79）AG 260（47.88）62.28±13.00 131/129 24.02±3.48 127（49.22）84（32.56）47（18.22）143.76±24.71 81.31±11.64 51.26±13.01 60/54 47/67 8.00（4.03）9.46±2.68 4.29（1.37）10（8.77）1.21（0.94）1.11（0.37）2.71（1.12）GG 160（29.47）59.93±11.83 82/78 24.75±3.44 69（43.12）49（30.63）42（26.25）0.08 0.31 0.08 0.21 141.60±24.79 79.25±11.82 54.00±13.39 135/125 95/165 8.35（4.51）9.59±2.44 4.31（1.59）27（10.42）1.29（0.95）1.11（0.40）2.60（1.08）145.52±24.68 81.86±11.27 50.55±11.10 89/71 65/95 7.49（3.60）9.36±2.26 4.50（1.51）26（16.25）1.34（1.23）1.12（0.44）2.78（1.37）

表4 不同基因型T2DM患者糖尿病并發(fā)癥比較

有研究證實，CDKAL1基因變異可以影響T2DM患者的臨床特征，如HbA1c和胰島素分泌[9-10]。同時，也與糖尿病風險因素BMI關聯(lián)[11]。FBG、餐后血糖和HbA1c是我們常規(guī)監(jiān)測血糖控制情況的三項指標，HbA1c反映的是2～3個月內(nèi)血糖控制的平均水平。本研究中，我們對不同基因型T2DM患者間的臨床特征進行了比較，發(fā)現(xiàn)GG基因型患者FBG較低，經(jīng)過性別和年齡校正后差異更加顯著（P＜0.01），但是HbA1c在不同基因型患者間并無顯著差異，我們推測這種差異可能是受餐后血糖的影響。多項研究證實，CDKAL1風險等位基因可能會影響胰島β細胞功能，使得第一時相胰島素分泌受損[9]，這一點在基因敲除小鼠研究中也得到證實[6]。第一時相胰島素分泌對降低餐后血糖有重要作用，它能迅速抑制內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生并抑制餐后血糖水平的升高，參與餐后高血糖的發(fā)生。因此，我們推測GG基因型患者的FBG偏低而HbA1c與其他基因型并無差異，可能是由餐后高血糖引起的，這還需要進一步研究。雖然，其他臨床特征如血壓、BMI和血脂等在各組間差異未見有統(tǒng)計學意義，但是經(jīng)過對BMI和TC分級統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，T2DM患者中肥胖和TC偏高者在GG基因型中所占比重最大。最近研究報道，在東亞人群中CDKAL1基因多態(tài)性位點（rs9956744和rs2206734）會影響B(tài)MI[11]，歐洲人群中也有類似的研究結(jié)果[15]。因此，不能排除rs7756992位點與BMI的關聯(lián)。

CDKAL1基因變異與T2DM并發(fā)癥的關系鮮見大規(guī)模的研究報道。由于CDKAL1基因與一個糖尿病微血管病變候選基因VEGF緊密連鎖[16]，最近國內(nèi)也有研究報道該基因可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關[12]，所以CDKAL1基因多態(tài)性位點是否與T2DM并發(fā)癥關聯(lián)值得進行探索性研究。但是在本研究中，通過我們的分析，未發(fā)現(xiàn)rs7756992位點與糖尿病的各種慢性并發(fā)癥存在相關性。

本研究中我們進一步證實了在中國漢族人群中，CDKAL1基因rs7756992多態(tài)性可以增加T2DM的發(fā)病風險，且不能排除其與血糖調(diào)節(jié)機制相關，另外，我們沒有發(fā)現(xiàn)該位點與糖尿病慢性并發(fā)癥關聯(lián)。因此，CDKAL1基因與T2DM的關系進一步得到驗證，該位點等位基因和基因型的檢測可以為T2DM發(fā)病風險和分型提供參考，利于疾病的早期診斷，值得進一步深入研究。

[1] The International Diabetes Federation(IDF). Diabetes Atlas.The Global Burden. 2011. http://www.idf.org/diabetesatlas/5e/the-global-burden.

[2] Yang W, Lu J, Weng J, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2010, 362(12):1090-1101.

[3] Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, et al. A genomewide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants[J]. Science, 2007, 316(5829):1341-1345.

[4] Wei FY, Tomizawa K. Functional loss of Cdkal1, a novel tRNA modification enzyme, causes the development of type 2 diabetes. Functional loss of Cdkal1, a novel tRNA modification enzyme, causes the development of type 2 diabetes[J]. Endocr J, 2011, 58(10):819-825.

[5] Pierrel F, Douki T, Fontecave M, et al. MiaB protein is a bifunctional radical-S-adenosylmethionine enzyme involved in thiolation and methylation of tRNA[J]. J Biol Chem,2004, 279(46):47555-47563.

[6] Wei FY, Suzuki T, Watanabe S, et al. Deficit of tRNA(Lys)modification by Cdkal1 causes the development of type 2 diabetes in mice[J]. J Clin Invest, 2011, 121(9):3598-3608.

[7] Steinthorsdottir V, Thorleifsson G, Reynisdottir I, et al. A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes[J]. Nat Genet, 2007, 39(6):770-511.

[8] Tan JT, Ng DP, Nurbaya S, et al. Polymorphisms identified through genome-wide association studies and their associations with type 2 diabetes in Chinese, Malays, and Asian-Indians in Singapore[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2010, 95(1):390-397.

[9] Hart LM, Simonis-Bik AM, Nijpels G, et al. Combined risk allele score of eight type 2 diabetes genes is associated with reduced first-phase glucose-stimulated insulin secretion during hyperglycemic clamps[J]. Diabetes, 2010, 59(1):287-292.

[10]Ryu J, Lee C. Association of glycosylated hemoglobin with the gene encoding CDKAL1 in the Korean Association Resource(KARE) study[J]. Hum Mutat, 2012, 33(4):655-659.

[11]Okada Y, Kubo M, Ohmiya H, et al. Common variants at CDKAL1 and KLF9 are associated with body mass index in east Asian populations[J]. Nat Genet, 2012, 44(3):302-306.

[12] 付麗麗, 林嬰, 楊正林, 等. TCF7L2, CDKAL1, SLC30A8和HEEX 基因多態(tài)性與2 型糖尿病微血管并發(fā)癥的相關性[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志, 2012, 29(2):194-199.

[13]Xu M, Bi Y, Xu Y, et al. Combined effects of 19 common variations on type 2 diabetes in Chinese: results from two community-based studies[J]. PLoS One, 2010, 5(11):e14022.

[14] Liu Y, Yu L, Zhang D, et al. Positive association between variations in CDKAL1 and type 2 diabetes in Han Chinese individuals[J]. Diabetologia, 2008, 51(11):2134-2137.

[15]Manning AK, Hivert MF, Scott RA, et al. A genome-wide approach accounting for body mass index identifies genetic variants influencing fasting glycemic traits and insulin resistance[J]. Nat Genet, 2012, 44(6):659-669.

[16]Lu F, Qian Y, Li H, et al. Genetic variants on chromosome 6p21.1 and 6p22.3 are associated with type 2 diabetes risk:a case-control study in Han Chinese[J]. J Hum Genet, 2012,57(5):320-325.