王麗芳，陳婷婷，王 琪，韓建榮*

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006;2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

蘆筍(Asparagus officinalisL.)為百合科天門(mén)冬屬植物，原產(chǎn)歐洲南部地中海沿岸及小亞細(xì)亞，已有2 000多年的栽培歷史。在西方，蘆筍被視為珍貴上等、藥食兼用的蔬菜，有“菜中之王”的譽(yù)稱［1］。我國(guó)從美國(guó)引種蘆筍以來(lái)，現(xiàn)種植面積已達(dá)6.67萬(wàn) hm2以上［2］，主要分布于福建、江蘇、浙江、河南、安徽和山西等?。?］，尤其山西省永濟(jì)市，目前已成為年采收面積近2萬(wàn)hm2的全國(guó)最大蘆筍生產(chǎn)基地。蘆筍的可食部分是其嫩莖，嫩莖的采收有嚴(yán)格的季節(jié)限制和采收標(biāo)準(zhǔn)。每年在收獲季節(jié)過(guò)后，蘆筍的地上莖仍要繼續(xù)生長(zhǎng)，高度可長(zhǎng)到1.5 m以上，有時(shí)甚至達(dá)到2 m以上，蘆筍的這部分莖稱之為蘆筍老莖。與嫩莖相比，蘆筍老莖由于木質(zhì)纖維化程度較高，失去了食用價(jià)值，每年的產(chǎn)量要遠(yuǎn)大于可食用的蘆筍嫩莖的量。大量的蘆筍老莖收割后沒(méi)有加以充分利用，只能任其自然腐敗，或直接焚燒，這樣既造成資源的極大浪費(fèi)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，如何有效利用蘆筍老莖是蘆筍產(chǎn)地種植農(nóng)戶和加工企業(yè)急需解決的問(wèn)題。由于多種農(nóng)業(yè)廢棄物可以用來(lái)栽培食用菌，所以作為食用菌培養(yǎng)料是利用蘆筍老莖的有效途徑之一。針對(duì)如何利用蘆筍老莖資源的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了一系列的研究工作，已經(jīng)證明了蘆筍老莖經(jīng)堆制發(fā)酵后可以用來(lái)栽培姬松茸(Agaricus blazei)［4］。蘑菇堆肥是一個(gè)復(fù)雜而又獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)，是一種由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用，有效分解有機(jī)物的動(dòng)態(tài)生化過(guò)程［5-6］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蘑菇培養(yǎng)料堆制發(fā)酵期間微生物的生物量、群落結(jié)構(gòu)變化的研究已有大量報(bào)道［7-8］。由于蘆筍老莖是一種不同于稻草、麥稈等秸稈的原料，所以其堆制發(fā)酵期間的微生物群落及其演替變化規(guī)律也必然不同于其他原料的堆料。要建立和完善針對(duì)蘆筍老莖的堆制發(fā)酵工藝，進(jìn)而得到一種高質(zhì)量的蘑菇培養(yǎng)料，對(duì)于蘆筍老莖堆制發(fā)酵期間微生物多樣性的研究是非常必要的。研究表明，嗜熱微生物(包括細(xì)菌、放線菌和真菌)是蘑菇堆肥高溫期的主要優(yōu)勢(shì)菌群［9-10］。本研究對(duì)蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細(xì)菌進(jìn)行了初步的分離鑒定研究，旨在為下一步制備蘆筍老莖堆料發(fā)酵菌劑以及調(diào)控堆料過(guò)程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑藥品 試劑盒:Real Times瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;Trans EasyTaqDNA polymerase(5 units/μL)、dNTP(10 mmol/L)、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、FastDigestEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(FD0274)、克隆載體pEASY-T3、宿主感受態(tài)細(xì)胞Trans 1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素、IPTG、X-gal均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;引物:細(xì)菌16S rDNA序列的通用引物(27F-1541R)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［11］:用于細(xì)菌分離，使用前加入制霉菌素(30 U/mL培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 堆肥配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%):蘆筍老莖70，棉籽殼20，豆餅7.5，過(guò)磷酸鈣1，石膏粉1，尿素0.5。按照二次發(fā)酵法進(jìn)行堆料發(fā)酵，前發(fā)酵18 d，共翻堆4次，移入室內(nèi)進(jìn)行后發(fā)酵，60℃保持10 h，50℃保持4 d。以蘆筍老莖堆料堆體四周及中心處為采樣點(diǎn)，采樣深度約20 cm左右，四分法采樣。在前發(fā)酵每次翻堆前和后發(fā)酵前后共采樣6次，采樣時(shí)間分別為建堆后第4天、第6天、第9天、第11天、第15天和第22天，采集的樣品依次編號(hào)為A、B、C、D、E和F，每次取樣量為500 g，按每袋100 g裝入無(wú)菌牛皮紙袋，該樣品必須在0～4℃保存，并盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 菌株分離 準(zhǔn)確稱取1 g堆肥樣品于99 mL裝有玻璃珠的無(wú)菌水中，充分振蕩后，靜置，采用倍比稀釋法將樣品稀釋至10－3、10－4、10－5、10－6稀釋度。分別吸取10－4、10－5、10－6稀釋度懸液0.2 mL，涂布于牛肉膏蛋白胨平板，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)，45℃培養(yǎng)12 h后觀察，并挑取單菌落。將分離到的菌株分別編號(hào)。

1.2.3 菌株鑒定 ①細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增模板的制備:采用菌落PCR方法［9］制備細(xì)菌的16S rDNA片段。具體步驟:每株菌取10個(gè)單菌落，加1 mL ddH2O煮沸5 min后，12 000 r/min離心2 min，取上清液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;②16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增:為了獲得高質(zhì)量的16S rDNA PCR產(chǎn)物，對(duì)模板量和菌落煮沸時(shí)間進(jìn)行了比較。模板量設(shè)計(jì)如下5個(gè)梯度:2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 μL。煮沸時(shí)間設(shè)計(jì)如下5個(gè)梯度:1、3、5、7和9 min。反應(yīng)體系(25 μL):10×Trans EasyTaqBuffer，2.5 μL;dNTP，1 μL;引物(20 μmol/L)各2.5 μL;Trans EasyTaqDNA polymerase，0.5 μL;DNA 模板，0.5 μL;ddH2O 補(bǔ)至25 μL。各試劑加好后，輕輕混勻。陰性對(duì)照不加模板。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃、5 min;變性94℃、30 s;退火55℃、30 s;延伸72℃、90 s;35個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物和回收產(chǎn)物均經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，UV凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè);③16S rDNA片段PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序:1)連接:向無(wú)菌離心管中加入目的片段16S rDNA回收產(chǎn)物4 μL和載體1 μL，混勻后于25℃反應(yīng)30 min，4℃反應(yīng)16 h;2)轉(zhuǎn)化(無(wú)菌操作):a.取感受態(tài)細(xì)胞(100 μL)，將5 μL 連接產(chǎn)物全部加入其中，溫和混勻，冰浴放置30 min;b.迅速轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱激30 s，再迅速冰浴冷卻2 min后，加入900 μL LB培養(yǎng)基，37℃下90 r/min振蕩培養(yǎng)50 min;c.取上述菌液，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液900 μL，剩下的100 μL，加入10 μL IPTG(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20%)和20 μL X-gal(20 mg/mL)，混勻后，輕輕涂到LB平板(含有氨芐青霉素，其終濃度為50 μg/mL)，涂勻。37℃培養(yǎng)12～16 h后可見(jiàn)藍(lán)色或淺黃色菌落;3)重組子的擴(kuò)大培養(yǎng):a.挑取連接轉(zhuǎn)化體單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素，其終濃度為50 μg/mL)中，37℃下200 r/min過(guò)夜培養(yǎng);b.將培養(yǎng)好的菌液分成2管，1管提取質(zhì)粒DNA作酶切篩選用，另1管留作測(cè)序用。EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切篩選:向無(wú)菌EP 管中依次加入8 μL ddH2O、0.5 μLEcoR Ⅰ Buffer、1 μL 質(zhì)粒DNA、0.5 μLEcoRⅠ，于37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，含有目的片段重組子的大小總共約為4 600 bp;4)重組子測(cè)序:選取含目的片段的重組子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由華大基因研究中心完成?？寺【幪?hào)方法:因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)樣品來(lái)自于蘆筍老莖堆料(Asparagus old stem compost)，所以克隆編號(hào)方法為“ASC+重組子號(hào)”;④菌株16S rDNA序列的同源性分析:將測(cè)序獲得的陽(yáng)性克隆的16S rDNA序列運(yùn)用CHECK_CHIMERA程序在線進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)并去除明顯的Chimera序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.gov/)中用VECTOR SCREEN程序剔除載體序列，經(jīng)BLAST比對(duì)后對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析。將本實(shí)驗(yàn)獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最相似的序列一起使用軟件Clustal X 1.8和MEGA 3.1，采用鄰近法(Neighor Joining)法，在Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter)下，繪制相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù);⑤16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào):本實(shí)驗(yàn)所獲得的16S rDNA序列均已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為JQ795996～JQ796008。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

45℃條件下，采用稀釋涂布法和劃線分離法從蘆筍老莖堆肥6個(gè)樣品中共分離出菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的22株細(xì)菌，其中A樣品6株，B樣品6株，C樣品4株，D樣品2株，E樣品2株，F(xiàn)樣品2株。

2.2 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:模板生物量對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不大，只要在2.5～12.5 μL 范圍內(nèi)即可得到理想的PCR產(chǎn)物(圖1);煮沸時(shí)間對(duì)PCR結(jié)果有影響，煮沸時(shí)間不能太長(zhǎng)，1、3、5 min都可以得到較理想的PCR產(chǎn)物，而7 min和9 min的目的產(chǎn)物較少而非特異性產(chǎn)物較多(圖2)。

圖1 模板量對(duì)16S rDNA PCR擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of amounts of template on PCR-amplified 16S rDNA

圖2 煮沸時(shí)間對(duì)16S rDNA PCR擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of boiling times on PCR-amplified 16S rDNA

2.3 菌株16S rDNA序列的測(cè)定和比對(duì)

分離到的22株嗜熱細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1，同源性分析結(jié)果如下:A樣品中，6株均屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)，分別與地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis(GU191905)、Bacillus massilliensis(DQ350816)、枯草芽胞桿菌枯草亞種Bacillus subtilissubsp.subtilis(GU191916)、芽胞桿菌Bacillussp.(EU362153)、蠟狀芽胞桿菌Bacilluscereus(FJ189786)、嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高。

表1 樣品中的細(xì)菌菌株16S rDNA序列的比對(duì)結(jié)果Table1 Identification of the bacteria strains isolated from six samples by the 16S rDNA

B樣品中，1株屬于假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)，1株屬于腸桿菌屬(Enterobacter);4株屬于芽胞桿菌屬，分別與地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis(GU191905)、Bacillus massilliensis(DQ350816)、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus(FJ189786)、嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高。C樣品中，1株屬于芽胞桿菌屬，1株屬于假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)，1株屬于類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)，1株與短短芽胞桿菌Brevibacillus brevis(AP008955)的同源性最高。D樣品中，1株與地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis(GU191905)的同源性最高，菌株D-b2在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到與其相似的已知細(xì)菌序列，分類地位待定。E樣品中，1株與嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高，1株與Pseudoxanthomonassp.(HQ912776)的同源性最高。F樣品中，1株與Pseudoxanthomonassp.(HQ912776)的同源性最高，1株與副球菌Paracoccussp.(EF070124)的同源性最高。從鑒定結(jié)果可以看出樣品間菌株有重復(fù)，根據(jù)同源性分析的結(jié)果將6個(gè)樣品中的12株細(xì)菌的16S rDNA序列和同源性最高的已知菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細(xì)菌主要是芽胞桿菌(Bacillusspp.)和假黃色單胞菌(Pseudoxanthomonasspp.)。

3 討論

常規(guī)PCR擴(kuò)增前需要制備、純化模板DNA，其方法主要有酸酚法、堿酚法、堿性SDS裂解法、煮沸裂解法和氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法等［12］。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn):有的操作繁瑣、難度大，有的成本較高。例如，作為一種經(jīng)典的方法，酚-氯仿抽提法是通過(guò)蛋白酶K的消化及有機(jī)試劑酚、氯仿的抽提獲得基因組DNA。這種方法獲得的DNA雖然質(zhì)量較高，但試劑昂貴，操作繁瑣，需要一些特殊處理，因此DNA的產(chǎn)率較低，需要大量的菌種材料。另外，酚、氯仿等試劑不僅對(duì)DNA有害，而且其殘留還會(huì)抑制PCR反應(yīng)中Taq酶的活性［13］。菌落PCR方法最早是由Güssow和Clackson［14］提出的。用無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板。該方法省去抽提模板DNA這一步，不失為一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的好方法［15］。

本實(shí)驗(yàn)嘗試采用菌落PCR方法，不提取基因組DNA，而是直接以菌體煮沸后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)對(duì)模板生物量和煮沸時(shí)間分別設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度，結(jié)果證明該方法可以很好地大規(guī)模地對(duì)蘆筍老莖堆料中分離到的多個(gè)菌株進(jìn)行鑒定。不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率、降低了實(shí)驗(yàn)成本，還可減少或避免因操作步驟過(guò)多產(chǎn)生污染所帶來(lái)的假陽(yáng)性等問(wèn)題，是一種切實(shí)可行的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法。

國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于蘑菇堆肥中微生物的研究報(bào)道［16-19］。在前發(fā)酵階段，料溫升至60℃以上時(shí)，細(xì)菌大量繁殖，降解掉原料中簡(jiǎn)單的易被降解的糖類物質(zhì)［20］。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細(xì)菌主要是芽胞桿菌(Bacillusspp.)、假黃色單胞菌(Pseudoxanthomonasspp.)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的其他秸稈堆肥中的優(yōu)勢(shì)嗜熱可培養(yǎng)細(xì)菌基本相符［16-19］。值得注意的是本實(shí)驗(yàn)分離得到的細(xì)菌中有1株在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到與其相似的已知菌株的序列，分類地位待定，這為下一步從蘆筍老莖堆料中篩選分離有價(jià)值的新嗜熱可培細(xì)菌提供了可能。

圖3 樣品中12株細(xì)菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of 12 strains from the samples

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