呂運(yùn)通，王文嶺，楊蓉婭，夏志寬，李海濤

阿薩希毛孢子菌( Trichosporon asahii, T. asahii)是毛孢子菌屬中常見(jiàn)的深部致病菌，在免疫功能低下的宿主可導(dǎo)致致命的系統(tǒng)感染，但目前對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)、致病機(jī)制尚不十分清楚。1957 年，Girbardt[1]在光學(xué)顯微鏡下，觀察到位于菌絲頂端（hyphal tip）有一小的、易染色的球狀小體，這個(gè)球狀體被稱(chēng)為頂體，與菌絲生長(zhǎng)有著密切關(guān)系，頂體已經(jīng)在構(gòu)巢曲霉[2,3]、煙曲霉[4,5]等多種真菌中被證實(shí)。T. asahii 在生長(zhǎng)過(guò)程中可以出現(xiàn)孢子、芽胞、芽管、菌絲、關(guān)節(jié)菌絲等多種結(jié)構(gòu)[6]，這些結(jié)構(gòu)的形成與頂體有什么關(guān)系，我們對(duì)此進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

T. asahii（CBS 2479，購(gòu)自荷蘭CBS 公司）由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心惠贈(zèng)，-80℃保存。FM4-64 熒光染劑（美國(guó)Biotium 公司，激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm），二甲基亞砜（DSMO）（美國(guó)Sigma 公司），細(xì)胞松弛素D（以色列Fermentek 公司）。leica dm3000熒光數(shù)碼拍攝系統(tǒng)，濾光片LP560 (Ex543/Em560)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備和培養(yǎng)

取濃度為106/ml 的T. asahii 菌懸液2 ml 分別轉(zhuǎn)種于7 份30 ml 無(wú)菌YPD 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)72 h。

1.2.2 T.asahii 頂體觀察 將FM4-64 溶解在DSMO中，終濃度為1.64 mmol/L。取0.5 ml 的菌懸液，加入2 μl 溶解好的FM4-64，孵育10 ～20 min，3 000 r/min 離心5 min，棄上清，加0.5 ml PBS 清洗2 次，3 000 r/min 離心5 min，取少量底層懸濁液涂片。在濾光片LP560（Ex543/Em560） 或LP505（Ex488/Em518）熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 不同濃度的細(xì)胞松弛素D 對(duì)T.asahii 的抑制 取濃度106/ml 的 2 ml T. asahii 菌液分別轉(zhuǎn)種于4 份30 ml 無(wú)菌YPD 培養(yǎng)基中，加入細(xì)胞松弛素D 分別致終濃度：0.5，1，2 μmol/L，不加細(xì)胞松弛素D 的為對(duì)照組。37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)72 h。熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 T.asahii 頂體觀察

孢子和芽胞頂端有較明顯的熒光（圖1a，1b），部分芽管的兩端可見(jiàn)明顯的熒光（圖1c，1d），菌絲頂端可見(jiàn)熒光（圖1e，1f）。除了可觀察到菌絲明顯熒光，偶可見(jiàn)到假菌絲的一端有明顯的熒光（圖1g），部分假菌絲兩端同時(shí)出現(xiàn)熒光（圖1h），同時(shí)觀察到鏈珠狀孢子內(nèi)較彌散較明顯的熒光（圖1i）。

2.2 細(xì)胞松弛素D 對(duì)T.asahii 生長(zhǎng)的影響

對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)良好，細(xì)長(zhǎng)形，其頂端和近頂端可見(jiàn)明顯的熒光（圖2a，2b），經(jīng)不同濃度的細(xì)胞松弛素D 處理后的T.asahii，菌絲生長(zhǎng)受到明顯的抑制，頂端熒光消失，熒光散在其體內(nèi)。

細(xì)胞松弛素D 的濃度為0.5 μmol/L 時(shí)，菌絲增粗，頂端及近頂端未見(jiàn)明顯的熒光（圖2c，2d）；1 μmol/L 時(shí)，菌絲進(jìn)一步縮短，其體內(nèi)熒光點(diǎn)狀散在分布（圖2e，2f）；2 μmol/L 時(shí)，菌絲呈現(xiàn)芽管形態(tài)，其體內(nèi)熒光少量聚集或散在（圖2g，2h）。

3 討論

圖1 T.asahii 各種生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)中的頂體（熒光顯微鏡×100）

圖2 細(xì)胞松弛素D對(duì)T.asahii生長(zhǎng)影響（×100）

細(xì)胞極性的確立和維持，在真核生物的形態(tài)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。極性生長(zhǎng)的模式在生物界中普遍存在，如絲狀真菌的菌絲、苔蘚及蕨的原絲體、植物的花粉管和根毛、動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞等。真菌的分生孢子萌發(fā)后，萌發(fā)管沿單一方向連續(xù)生長(zhǎng)即頂端生長(zhǎng)，以發(fā)育成為成熟的菌絲。在此過(guò)程中伴隨著細(xì)胞核的分裂，細(xì)胞質(zhì)并不同步分裂。大多數(shù)真菌中，連續(xù)的幾次核分裂之后， 細(xì)胞質(zhì)才發(fā)生一次分裂，在遠(yuǎn)離菌絲頂端的一側(cè)形成隔，頂端細(xì)胞中的多個(gè)細(xì)胞核以非同步化的方式繼續(xù)分裂，在成熟的菌絲中一個(gè)細(xì)胞內(nèi)通常存在多個(gè)細(xì)胞核。絲狀真菌菌絲的生長(zhǎng)，與其他植物極性細(xì)胞生長(zhǎng)一樣，以細(xì)胞的頂端生長(zhǎng)為特征，其生長(zhǎng)僅限于菌絲頂端的穹窿區(qū)域，在直徑均勻的后部管狀區(qū)域則幾乎不再伸長(zhǎng)。菌絲的頂端生長(zhǎng)方式在一個(gè)世紀(jì)前已被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步闡述，指出菌絲的生長(zhǎng)速率在頂端最大，距端l pm 處胞壁的合成速率可能是50 pm 處的50 倍，而在伸長(zhǎng)區(qū)的基部，生長(zhǎng)速率可能降為零。

Grove 等[7]利用冷凍置換電子顯微鏡證實(shí)了頂體是一種富含分泌囊泡的小體，Bartnicki- Garcia 等[8]提出囊泡供給中心模型（the vesicle supply center model，VSC），并且指出分泌囊泡在頂體集聚，然后被運(yùn)送到細(xì)胞表面，與細(xì)胞膜融合并且釋放分泌囊泡里面的物質(zhì)，計(jì)算機(jī)模型顯示在細(xì)胞表面的分泌囊泡呈現(xiàn)濃度梯度分布。

頂體的主要結(jié)構(gòu)為分泌囊泡（secretory vesicles），頂體在功能上一般認(rèn)為與微管組織中心(microtubule organizing center，MTOC) 有關(guān)。 在動(dòng)物細(xì)胞中，MTOC 是中心體，中心體可隨細(xì)胞周期進(jìn)行復(fù)制，并且在分裂期形成紡錘體的兩極；在真菌細(xì)胞中，MTOC 是紡錘體極體(spindle pole body，SPB)，MTOC 位于頂體之內(nèi)，已經(jīng)通過(guò)免疫定位技術(shù)在巨雌異水霉（Allomyces macrogynus）得到證實(shí)[9]。頂體內(nèi)聚集的分泌囊泡起著運(yùn)送菌絲極性生長(zhǎng)所需物質(zhì)的作用，通過(guò)對(duì)真菌囊泡為基礎(chǔ)的數(shù)學(xué)模型的觀察，發(fā)現(xiàn)頂體就是一個(gè)涉及到細(xì)胞膜擴(kuò)張的可移動(dòng)囊泡的中心[10]。Reynaga-Pe?a 等[11]已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)改變頂體的位置可以改變菌絲生長(zhǎng)的方向，這就印證了Girbardt 所提出頂體可以控制菌絲生長(zhǎng)方向的假說(shuō)。

FM4-64 是兩性苯乙烯基熒光染料，這種染料有比較好的耐光性和較小的細(xì)胞毒性，通過(guò)細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用透過(guò)細(xì)胞膜分布在分泌小泡膜的表面[12]。我們應(yīng)用兩性苯乙烯基熒光染料FM4-64 對(duì)T. asahii進(jìn)行了觀察研究，發(fā)現(xiàn)：①在芽胞、芽管、假菌絲、菌絲的近頂端都可以觀察到頂體這一結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出來(lái)的較強(qiáng)熒光。②假菌絲的兩端有時(shí)會(huì)同時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而在菌絲中這種現(xiàn)象是不存在的，可以推測(cè)假菌絲的生長(zhǎng)也是受頂體所調(diào)控，這和其他真菌存在差異，從而提示T. asahii 的假菌絲尚有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)為菌絲的可能。在串珠狀孢子的體內(nèi)熒光散在分布，提示此時(shí)的T. asahii 不具備或已經(jīng)喪失了極性生長(zhǎng)的能力，或者正在孕育下一次的出芽。③加入細(xì)胞松弛素D 抑制頂體形成后，可以看到菌絲形成和生長(zhǎng)受到顯著抑制。隨著細(xì)胞松弛素D 濃度的提高，菌絲形成的抑制越來(lái)越顯著，直至菌絲形成完全抑制，只能形成粗短的芽管，這一現(xiàn)象表明細(xì)胞松弛素D 能夠通過(guò)抑制分泌囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制頂體的形成。

[1] Girbardt M. Der Spitzenk?rper von Polystictus versicolor [J]. Planta, 1957, 50(1):47-59.

[2] Jackson-Hayes L, Hill TW, Loprete DM, et al. GDP-mannose transporter paralogues play distinct roles in polarized growth of Aspergillus nidulans [J]. Mycologia, 2010, 102(2):305-310.

[3] Higashitsuji Y, Herrero S, Takeshita N, et al. The cell end marker protein TeaC is involved in growth directionality and septation in Aspergillus nidulans [J]. Eukaryot Cell, 2009, 8(7):957-967.

[4] Li Y, Zhang L,Wang D, et al. Deletion of the msdS/AfmsdC gene induces abnormal polarity and septation in Aspergillus fumigatus [J]. Microbiology, 2008, 154(Pt7):1960-1972.

[5] Li H, Barker BM, Grahl N, et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus [J]. Eukaryot Cell, 2011, 10(2):174-176.

[6] Wang WL, Yang RY, Ao JH, et al. Uncommon characteristics of the structure and development of Trichosporon asahii [J]. Chin Med J, 2009, 122(15):1806-1810.

[7] Grove SN, Bracker CE. Protoplasmic organization of hyphal tips among fungi: Vesicles and Spitzenk?rper [J]. J Bacteriol, 1970, 104(2):989-1009.

[8] Bartnicki-Garcia S, Hergert F, Gierz G. Computer-simulation of fungal morphogenesis and the mathematical basis for hyphal (tip) growth [J]. Protoplasma, 1989, 153(1-2):46-57.

[9] Virag A, Harris SD. The Spitzenk?rper：a molecular perspective [J]. Mycol Res, 2006, 110 (Pt1):4-13.

[10] Straube A, Brill M, Oakley BR, et al. Micro-tubule organization requires cell cycle-dependent nucleation at dispersed cytoplasmic sites: polar and perinuclear microtubule organizing centers in the plant pathogen Ustilago maydis [J]. Mol Biol Cell, 2003, 14(2):642-657.

[11] Reynaga-Pe?a CG, Gierz G, Bartnicki-Garcia S. Analysis of the role of the Spitzenk?rper in fungal morphogenesis by computer simulation of apical branching in Aspergillus niger [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(17):9096-9101.

[12] Fischer-Parton S, Parton RM, Hickey PC. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae [J]. J Microsc, 2000, 198(3):246-259.