王曉晨 ，蘭永輝，張小平，劉人源

（1華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2東江環(huán)保股份有限公司，廣東 深圳 518057，3梅州環(huán)保設(shè)備有限公司，廣東 梅州 514700）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對能源的要求越來越高，微藻被認(rèn)為是制備生物柴油燃料的理想原料。藻具有光合效率高、零凈碳值、易培養(yǎng)、生長周期短、油烴含量高等優(yōu)點(diǎn)，且不與農(nóng)爭地，不與人爭糧 ，不影響全球能源分配，其作為生物能源，已引起各國政府和學(xué)者的高度關(guān)注[1]。微藻制備生物柴油的研究工藝包括產(chǎn)油微藻的篩選、微藻培養(yǎng)系統(tǒng)、微藻的收集分離、藻油的提取、微藻油脂制取生物柴油等過程。陳國等[2]對含油微藻制備生物柴油的工藝過程做了相關(guān)闡述。其中微藻油脂含量的測定是研究和開發(fā)高產(chǎn)油微藻的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

測定微藻藻油的方法有多種,包括有機(jī)溶劑提取法、索氏提取法、尼羅紅熒光染料測定法、蘇丹黑染色法、超臨界 CO2提取法和離子液體提取法等[3]。選擇一個快速、簡便、高效、靈敏的測定方法就成了一個研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在以上方法的基礎(chǔ)上，對溶劑提取-尼羅紅熒光光譜法和溶劑提取-水浴蒸干稱重法進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明溶劑提取-尼羅紅熒光光譜法有一定優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 主要材料

藻種：①蛋白核小球藻（Chlorella Pyrenoidosa），由華南理工大學(xué)食品學(xué)院提供；②絲狀藻（顯微鏡觀察），廣州大學(xué)城華南理工大學(xué)池塘打撈。

試劑：0.1 mol/LPBS緩沖溶液（pH= 7.4），二甲基亞砜（DMSO）（CP），1 g/L尼羅紅母液（將100 mg尼羅紅溶于100 mL丙酮中），10 g/L三油精（取1 g三油精溶于100 mL異丙醇中），正己烷（CP），2 mol/L KOH-CH3OH 溶液，2 mol/L HCl-CH3OH溶液。

尼羅紅（Nile Red），99%，由百靈威提供；三油精（三油酸甘油酯），CP，由阿拉丁提供。

儀器：JA2003N型電子天平，XSP-2CA型顯微鏡，80-2型離心機(jī)， L-4500型熒光分光光度計， 721N型可見分光光度計等，DKS-24電熱恒溫水浴鍋，SFG-02.500電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，GP-01光照培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻株培養(yǎng)

朱氏十號培養(yǎng)液的配制：純水1000 mL，硝酸鈣0.04 g，磷酸氫二鉀0.01g，硫酸鎂0.025 g，碳酸鈉0.02 g，硅酸鈉0.025 g，氯化鐵0.008 g。使用時按1倍濃度使用，不進(jìn)行稀釋。

用250 mL的錐形瓶裝200 mL朱氏十號培養(yǎng)液， 取少量蛋白核小球藻接種，瓶口以8層紗布封口后置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[溫度（25±0.5）℃，光照強(qiáng)度4000 lx，光暗比12h∶12h]。 定期振搖錐形瓶，以防止藻細(xì)胞沉淀堆積。

1.2.2 藻液細(xì)胞密度與吸光度關(guān)系的測定

取濃縮的蛋白核小球藻，用PBS清洗，然后稀釋成一定的密度梯度，以PBS緩沖液為空白，利用721N可見光分光光度計測其吸光度，同時用血球計數(shù)板進(jìn)行顯微計數(shù)（每個藻樣重復(fù)計數(shù)3次，取平均數(shù)）對吸光度與相應(yīng)的細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行回歸分析。

1.2.3 藻細(xì)胞干重與吸光度關(guān)系的測定

取PBS清洗過的蛋白核小球藻，按倍數(shù)稀釋成6個濃度梯度，分別測定6個濃度下的吸光度，每個樣取20 mL，過濾，干燥箱中45 ℃干燥，稱重。繪制藻細(xì)胞干重與吸光度關(guān)系曲線，并并回歸分析。

1.2.4 微藻油脂與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線的繪制

用標(biāo)準(zhǔn)加入法[5]測定微藻中油脂的絕對含量，取一個生長至對數(shù)末期的藻樣，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用PBS緩沖溶液清洗，然后稀釋成一定濃度的藻液（吸光度一般要求在0.500左右，最大不能超過1.000）。取5個30 mL試劑瓶，標(biāo)號1～5號，分別加入藻液19.8 mL，不同濃度的三油精溶液（200 μL異丙醇，180 μL 異丙醇+20 μL 的三油精，160 μL 異丙醇+40 μL 的三油精，140 μL異丙醇+60 μL的三油精，120 μL異丙醇+80 μL的三油精）0.2 mL。根據(jù)藻液體積依次加入二甲基亞砜（加入后二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為 20%），尼羅紅（加入后尼羅紅濃度為0.3 μg/mL），染色20 min后測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波波長488 nm，發(fā)散光范圍400～700 nm，狹縫寬度均為10 nm，電壓值400 V）[4-5]。

1.2.5 油脂的提取及測定

將打撈的藻濃縮干燥后，均取10 g放入兩個250 mL錐形瓶中，各加入60 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH，于75 ℃水浴加熱10 min進(jìn)行皂化。冷卻至室溫后再各加入120 mL 2 mol/L的HCl-CH3OH，于75 ℃水浴加熱 10 min進(jìn)行甲酯化。再次冷卻至室溫后加入60 mL正己烷，放置10 min，進(jìn)行分層，取正己烷層。其中，一份在80℃水浴蒸除正己烷，得到粗油脂，稱重，計算油脂的提取率；另一份取0.2 mL加入19.8 mL的藻樣（1.2.4節(jié)中PBS稀釋的一定濃度藻樣）中，然后按1.2.4節(jié)方法測定熒光，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻液細(xì)胞密度與吸光度的相關(guān)性

呂旭陽等[6]實(shí)驗(yàn)報道，在680 nm波長下測定小球藻藻液濃度，其靈敏度高、數(shù)據(jù)更精確。黃美玲等[7]也研究發(fā)現(xiàn)在540～700 nm 范圍內(nèi)蛋白核小球藻吸光值與細(xì)胞密度存在理想的線性關(guān)系， 線性系數(shù)r＞ 0.999，其中以 680 nm 波長處最為靈敏，其次為 540 nm。本工作以 680 nm處測得的吸光度OD680（X）為橫坐標(biāo)，以顯微計數(shù)得到的細(xì)胞密度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析（圖 1），得到藻的線性方程為Y=(10.935X)×109（R2=0.9991）。表明藻液吸光度與細(xì)胞密度呈顯著正相關(guān)，說明藻液細(xì)胞密度可以用吸光度OD680來表示。

2.2 藻細(xì)胞干重與吸光度的相關(guān)性

黃美玲等[7]研究表明，小球藻吸光度和干重之間存在很好的線性關(guān)系。按照1.2.3節(jié)的方法，用相同體積不同濃度下藻細(xì)胞干重對吸光度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如圖 2。由圖 2可以看出，在吸光度為0.000～1.000之間時，藻干重和吸光度只見面有很好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.6738X–0.0327，相關(guān)性系數(shù)為R2=0.9995。吸光度大于1.000時，藻干重和吸光度之間的相關(guān)性顯著降低。

2.3 不同培養(yǎng)條件下藻油脂的熒光特性分析

蛋白核小球藻的熒光強(qiáng)度和藻內(nèi)油脂含量呈線性關(guān)系[5]。用熒光分光光度計在488 nm的激發(fā)波長處對各藻樣做分析（方法見文獻(xiàn)[8]），結(jié)果見圖3。對各樣的熒光峰值和加入的三油精濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出熒光峰值和加入的三油精濃度有較好的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為R2=0.9661，對應(yīng)的回歸方程為Y=0.2771X+6.9608。

圖1 藻液細(xì)胞密度與吸光度的關(guān)系曲線

圖2 藻干重和吸光度的關(guān)系曲線

同時，從直線和X軸的交點(diǎn)，可以得出藻內(nèi)油脂三油酸當(dāng)量含量為25.1mg/L。用于標(biāo)準(zhǔn)加入法的藻吸光度為0.567，根據(jù)藻密度和吸光度的線性關(guān)系Y=10.935X×109（R2=0.9991），計算得出相應(yīng)的藻密度為6.20×109個/ L。再結(jié)合藻干重和吸光度的線性關(guān)系Y=0.6738X–0.0327（R2=0.9995），計算得出相應(yīng)的藻干重 0.35g/L。因此就可以量化出單位蛋白核小球藻干重對應(yīng)的三油精油脂當(dāng)量含量，用于標(biāo)準(zhǔn)加入法的蛋白核小球藻油脂當(dāng)量含量為72.5mg/g干藻。同時可以得出用培養(yǎng)箱培養(yǎng)的蛋白核小球藻藻油脂含量為 7.25%。說明通過建立藻密度、藻干重、藻液吸光度、熒光強(qiáng)度、油脂之間的關(guān)系，就可以得出藻體內(nèi)油脂的積累量。熒光法測定微藻油脂含量是一個快速、簡便、高效的方法[9-10]。

2.4 水浴干燥稱重與熒光法測定結(jié)果比較

圖3 各標(biāo)樣的熒光曲線

圖4 油脂濃度和熒光峰值曲線

參考咸漠的堿法甲酯化方法[11]，對堿法甲酯化方法改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)使用堿法皂化加酸法甲酯化法處理微藻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理過的微藻沉積物變成白色的，經(jīng)顯微鏡觀察破壁比較徹底，運(yùn)用該法預(yù)處理微藻后，再用熒光測定油脂含量，可以使得油脂染色比較充分，避免了直接使用熒光尼羅紅染色不夠徹底的問題[7]。同時得到的微藻油脂含量比較接近真實(shí)值。另外，和超聲或者 DMSO處理-尼羅紅染色測熒光的方法[7]比較，溶液提取-熒光光譜法測定的是提取后的藻油，超聲或者 DMSO處理-熒光法測定的是藻體。藻體養(yǎng)到一定時期后就需要及時測定，不能長期存放，若是實(shí)驗(yàn)失敗，就需要重新養(yǎng)藻；而提取的藻油可以存放，實(shí)驗(yàn)測定失敗，還可以再次配置測定。再者，當(dāng)藻液濃度大時，直接用藻體測熒光容易受葉綠素?zé)晒夥宓母蓴_，而用藻油測熒光就可避免葉綠素峰的干擾。

收集經(jīng)過KOH-CH3OH溶液及HCl-CH3OH溶液處理過的打撈藻，用正己烷提取后，一份用水浴蒸干，稱重，3次平行試驗(yàn)分別得到0.766 g、0.814 g、0.871 g的粗油脂，取平均值為0.817 g，得油脂提取率為 8.17%；另一份用熒光法測定正己烷提取物的熒光強(qiáng)度3次，結(jié)果如圖5，熒光峰值分別為54.06、55.83、55.75。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)加入法得出的油脂濃度和熒光峰值曲線關(guān)系Y=0.2771X+6.9608，分別計算得到油脂濃度為 16.997g/L、17.636 g/L、17.607 g/L，取平均值為17.413 g/L。60 mL正己烷中的油脂含量為 1.045 g，油脂提取百分率為10.45%。比較兩種測量法得出，油脂含量測量結(jié)果比較接近，說明熒光法可以用于測定微藻提取物中的油脂含量；熒光法測定的數(shù)值比烘干稱重法偏大，說明水浴干燥稱重法在提取過程中某些油脂會蒸發(fā)損失；以及分離正己烷層時提取物的流失；加上正己烷為非極性有機(jī)物，強(qiáng)極性的藻油脂溶于正己烷的量很少或者不溶。所以最后提取的油脂含量比較低，略小于熒光法測得值，兩種方法的測得值近似。每種有機(jī)溶劑對油脂的溶解度都有一個動態(tài)平衡，正己烷對處理藻的提取不夠徹底，也會導(dǎo)致提取率比較低；另外熒光法測量油脂的靈敏度高，被測油脂含量可以在微克級與毫克級范圍，而稱重法測量誤差大，如果提取油脂含量很低就可能測不出結(jié)果。

圖5 撈藻正己烷提取物的熒光曲線

通過分析，當(dāng)使用熒光法測定藻提取物中的油脂時，在一定體積一定濃度的藻液中加入一定量的藻提取物測熒光，同時測定藻液空白，通過藻密度、藻干重、吸光度、熒光峰值和油脂之間的關(guān)系，就可以得出單位藻干重中油脂的含量或藻提取物中的油脂量，并轉(zhuǎn)化為油脂的提取率。

3 結(jié) 論

（1）藻密度與吸光度、藻干重與吸光度以及熒光峰值和油脂之間均有良好的線性的關(guān)系，分別為Y=10.935X×109（R2=0.9991）；Y=0.6738X–0.0327（R2=0.9995）；Y=0.2771X+6.9608（R2= 0.9661）。通過這3個線性關(guān)系可以得出微藻體內(nèi)油脂的百分含量。用于內(nèi)標(biāo)法的微藻油脂含量經(jīng)過3個關(guān)系計算，得出結(jié)果為7.25%。

（2）使用堿法皂化-酸法甲酯化處理微藻，再用熒光測定油脂含量，避免了直接使用尼羅紅染色不夠徹底的問題。同時得到的微藻油脂含量比較接近真實(shí)值。實(shí)驗(yàn)用打撈藻熒光測定值為10.45%，大于水浴干燥稱重法測得值8.17%。

（3）熒光法測定微藻油脂含量是一個快速、簡便、高效、靈敏的方法，既可以直接測定活藻細(xì)胞中的油脂，又可以測定經(jīng)有機(jī)溶劑提取過的油脂。

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