羅 丹，馮 戟，馬紅雨，董 昭，王 婷，蔡 慶

對(duì)動(dòng)脈硬化發(fā)病機(jī)制及脂代謝異常的研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP－binding cassette transporter A1，ABCA A1)被認(rèn)為與脂代謝密切相關(guān)，ABCA1 R219K 的基因多態(tài)性可能與升高高密度脂蛋白及降低三酰甘油相關(guān)，但是國內(nèi)外的研究仍存在爭(zhēng)議［1，2］。飛行員血脂異常發(fā)生率較高，為27.2%［3，4］，本研究旨在探討飛行員人群中ABCA1 R219K 基因多態(tài)性分布的特點(diǎn)及其與血清脂類的關(guān)系，從分子水平進(jìn)一步認(rèn)識(shí)脂代謝紊亂。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取男性飛行員199 例，年齡21 ～55歲。分為血脂異常組91 例，年齡:22 ～53 歲，平均(35.43 ±8.36)歲;血脂正常的108 例作為對(duì)照組，年齡:21 ～55 歲，平均(35.41 ±8.71)歲，兩組年齡具有可比性(P ＞0.05)。血脂異常的判定嚴(yán)格按照高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。排除標(biāo)準(zhǔn):近期服用降脂藥物，具有高血壓、心、腦、糖尿病等疾病家族史者，體檢證實(shí)患有高血壓、心、腦、肝、腎疾病者。

1.2 標(biāo)本采集 空腹12 h 后采集2 管靜脈血，分別注入含分離膠的真空采血管，3000 r/min 離心10 min，分離血清用于檢驗(yàn);EDTA－2K 抗凝管用于提取DNA 及ABCA1 R219K 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism ，PCR－RFLP)測(cè)定。

1.3 生化檢驗(yàn) 應(yīng)用日立7180 生化分析儀，檢測(cè)前進(jìn)行伯樂化學(xué)質(zhì)控及血脂質(zhì)控，質(zhì)控均在在控前提下，進(jìn)行總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等檢測(cè)。

1.4 ABCA1R219K 基因多態(tài)性檢測(cè) 含有EDTA－2K 抗凝藥的血樣，采用人類外周血基因組提取試劑盒提取DNA，用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定ABCA1 R219K 基因多態(tài)性。

1.5 模板DNA 的提取 取EDTA－2K 抗凝血2 ml，用FICOLL 單個(gè)核細(xì)胞提取液提取外周血淋巴細(xì)胞，用QIAGEN 公司DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。

1.6 PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增ABCA1 R219K 基因引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成，序列參考文獻(xiàn)［6］:

上游引物:5'－GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTG ACA A－3'

下游引物:5'－GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A–3'

將PCR 反應(yīng)管置于PCR 擴(kuò)增儀(PE9600 型，美國)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括:上下游引物0.5 μmol/L，dNTP200 μmol/L，10 ×buffer 5 μl，Taq酶2.5 U，基因組DNA0.5 μg，總體積50 μl。反應(yīng)體系循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，再進(jìn)行以下循環(huán):95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s 循環(huán)35 次，72℃延伸10 min。取5 μl PCR 擴(kuò)增液于2% 瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。瓊脂糖電泳鑒定后4 ℃保存待酶切。

1.7 限制性酶切和電泳鑒定 限制性酶切體系為20 μl，PCR 產(chǎn)物10 μl，用限制性內(nèi)切酶EcoNI 15 U，10 × NEBuffer4 含(BSA)2 μl (為BIOLABS 公司)，酶切相應(yīng)PCR 產(chǎn)物，37 ℃消化過夜。2% 瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，進(jìn)行ABCA1R219K 判讀。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以±s 表示，采用成組t 檢驗(yàn)和方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標(biāo)的比較 兩組TC、TG、LDL－C存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，其他指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05，表1)。

表1 血脂異常組與對(duì)照組飛行員的生化指標(biāo)比較(±s)

表1 血脂異常組與對(duì)照組飛行員的生化指標(biāo)比較(±s)

各項(xiàng)指標(biāo)血脂異常組(n=91)對(duì)照組(n=108)P 24.68 ±9.71 25.75 ±16.07 0.713 AST(U/L)22.48 ±6.08 22.97 ±7.72 0.397 Cr(μmol/L)73.79 ±12.89 75.95 ±14.24 0.397 BUN(mmol/L)5.44 ±1.055.24 ±0.74 0.220 Glu(mmol/L)5.19 ±0.645.02 ±0.43 0.085 TC(mmol/L)4.95 ±0.944.40 ±0.66 ＜0.01 TG(mmol/L)2.53 ±1.581.13 ±0.47 ＜0.01 HDL－C(mmol/L) 1.15 ±0.331.24 ±0.29 0.172 LDL－C(mmol/L)ALT(U/L)3.14 ±0.722.77 ±0.57 ＜0.01

2.2 兩組樣本PCR 結(jié)果及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定

2.2.1 PCR 結(jié)果 兩組所有標(biāo)本的PCR 產(chǎn)物都在177 bp 處出現(xiàn)了目的條帶，見圖1。

圖1 ABCA1 R219K PCR 結(jié)果

2.2.2 ABCA1 R219K 基因多態(tài)性測(cè)定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)序列檢測(cè)證實(shí)與酶切結(jié)果一致，其中1 為RR型(177 bp)，2 為RK 型(177，107，70 bp)，3 為KK型(107，70 bp)，見圖2。

圖2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定

2.3 兩組ABCA1 R219K 的基因型比較 經(jīng)過Hardy－Weinberg 平衡驗(yàn)證，兩組樣本具有群體代表性，實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，ABCA1 R219K 基因多態(tài)性分布均符合Hardy－Weinberg定律(表2)?？傮w基因型頻率分別為RR(31.2%)，RK(50. 7%)，KK(18. 1%)，等位基因頻率為R(56.5%)，K(43.5%)。兩組ABCA1R219K 基因型的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.197，P =0.123);兩組ABCAIR219K 等位基因的分布頻率比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.564，P=0.109)，見表3。

表2 飛行人員ABCA1 R219K Hardy－Weinberg 平衡檢驗(yàn)(n;%)

表3 飛行人員血脂異常組與對(duì)照組ABCA1 R219K 基因型及等位基因頻率比較(n;%)

2.4 血脂異常組不同基因型與血脂的關(guān)系 血脂異常組ABCA1 R219K 不同基因型的個(gè)數(shù)分別為RR 型26 例，RK 型43 例，KK 型22 例。血脂異常組RR，RK，KK 基因型的HDL－C 水平相互比較，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.027)。不同基因型的TC、TG、LDL－C相互比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表4)。

表4 飛行人員血脂異常組不同基因型與血脂的關(guān)系(mmol/L;±s)

表4 飛行人員血脂異常組不同基因型與血脂的關(guān)系(mmol/L;±s)

注:與RR 組比較，①P ＜0.05

血脂RR 型RK 型KK 型P TC4.80±1.005.08±1.024.87±0.72 0.631 TG2.23±0.822.82±2.082.30±1.01 0.449 HDL－C 1.10±0.231.23±0.421.44±0.11①0.027 LDL－C3.23±0.793.08±0.753.13±0.61 0.834

3 討論

本研究中血脂異常組與對(duì)照組比較，ABCA1 R219K 在基因型與等位基因上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組基因型及等位基因分布無差異。其中等位基因K 頻率為43.5%，與國內(nèi)外研究結(jié)果比較，成都漢族人群為46.0%［7］、新疆維吾爾族男性40.1%［8］、廣西壯族人群36.0%［9］，德國人26%［10］、荷蘭人25.4%、芬蘭人22%［11］、美國人28%［12］，可見不同研究的等位基因頻率結(jié)果不同，造成等位基因頻率差異的原因可能與種族、地域、遺傳背景等因素有關(guān)。

本研究表明，血脂異常組飛行員的KK 基因型HDL－C 明顯高于其他兩種基因型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，這與文獻(xiàn)［3，13］報(bào)道的結(jié)果一致。原因是ABCA1 在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起第一步限速作用，是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的門衛(wèi)［14］，在巨噬細(xì)胞上，ABCA1 作為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子，通過ATP 結(jié)合域結(jié)合ATP，使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，并與細(xì)胞外的apoAI 結(jié)合，apoAI 參與形成前βHDL，形成成熟的HDL。ABCA1 R219K 是ABCA1 編碼序列常見多態(tài)性，是7 號(hào)外顯子第1051 位核苷酸由G變成A，使ABCA1 蛋白質(zhì)第219 位的精氨酸(R)變成賴氨酸(K)。由于HDL 屬于內(nèi)源性生成，受飲食影響較小，筆者認(rèn)為ABCA1 219 KK 基因型升高血清中HDL－C 的結(jié)果比較客觀，機(jī)制可能為ABCA1 R219K 基因變異使ABCA1 蛋白的活性提高，有利于HDL 的生成，從而起到抗動(dòng)脈硬化及降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)的作用，與文獻(xiàn)［15－17］報(bào)道一致。ABCA1 R219K 不同基因型對(duì)不同降脂藥物的應(yīng)答敏感性不同，KK 基因型比其他基因型具有明顯升高HDL水平的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［18，19］。因此，本研究推測(cè)ABCA1 不同基因型檢測(cè)可能用于患者的個(gè)體化治療。另外，血脂異常組中RK 基因型的HDL－C 低于KK 基因型，而高于RR 基因型，雖然差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但筆者認(rèn)為可能與樣本例數(shù)有限有關(guān)，推測(cè)RK 基因型可能引起HDL 輕度升高，RK 基因型與HDL－C 水平之間關(guān)系值得進(jìn)一步探討。

ABCA1 219K 不同基因型TG 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中沒有觀察到ABCA1 219K 有降低TG 的效果，分析原因可能為:TG 可能受工作環(huán)境的影響，尤其是飛行員這一特殊群體，工作長(zhǎng)期處于一個(gè)封閉的空間，注意力高度集中，交感神經(jīng)興奮，可能對(duì)TG 水平有一定的影響;另外，TG 可能受生活方式、樣本例數(shù)、飲食等因素影響，因此ABCA1 219K 與TG 的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

本研究證實(shí)，血脂異常組與對(duì)照組比較，ABCA1 R219K 在基因型與等位基因上的分布并無差異。ABCA1 R219K 多態(tài)性分析中，KK 基因型能夠明顯升高血清中HDL－C，故筆者認(rèn)為通過檢測(cè)ABCA1 R219K 基因型可能為飛行員心、腦血管疾病的預(yù)防及個(gè)體化治療提供新思路、新方法。

［1］ Ma X Y，Liu J P，Song Z Y，et al. Associations of the ATP－binding cassette transporter A1 R219K polymorphism with HDL－C level and coronary artery disease risk:a meta－analysis［J］. Atherosclerosis，2011，215(2):428－434.

［2］ 劉亞洋，郭志剛，屠 燕，等. ABCA1 基因編碼區(qū)SNP 檢測(cè)及R1587K 與血脂和冠心病的關(guān)系［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，31(4):300－302.

［3］ 劉 浩，呂曉寧，李鳴皋. 海軍飛行員代謝性疾病患病情況及其影響因素調(diào)查［J］.武警醫(yī)學(xué)，2011，22(6):485－487.

［4］ 馬春梅，葉道斌，毛積分，等. 中青年冠狀動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素分析［J］. 武警醫(yī)學(xué)，2012，23(4):309－311.

［5］ 中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(huì). 中國成人血脂異常防治指南［J］. 中華心血管病雜志，2007，35(5):390－419.

［6］ Clee S M，Zwinderman A H，Engert J C，et al. Common genetic variation in ABCA1 is associated with altered lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease［J］.Circulation，2001，103(9):1198－1205.

［7］ 吳 銀，白 懷，劉 瑞，等.中國人內(nèi)源性高三酰甘油血癥患者ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 基因R219K 多態(tài)性研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24(2):177－181.

［8］ 孫明慧，馬依彤，謝 翔，等.ABCA1 基因R2 1 9 K 多態(tài)性在新疆維吾爾族、漢族分布特征及與血脂水平關(guān)系［J］. 中華實(shí)用診斷與治療雜志，2011，25(1):14－17.

［9］ 黃 健，戴 玲，馬義麗，等. 廣西壯族人群ABCA1基因R219K 和I883M 多態(tài)性的分布［J］. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2007，4 (6):507－510.

［10］ Evans D，Beil F U. The association of the R219K polymorphism in the ATP－binding cassette transporter 1(ABCA1)gene with coronary heart disease and hyperlipidaemia［J］. J Mol Med (Berl)，2003，81(4):264－270.

［11］ Singaraja R R，Brunham L R，Visscher H，et al.Efflux and atherosclerosis:the clinical and biochemical impact of variations in the ABCA1 gene［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(8):1322－1332.

［12］ Benton J L，Ding J，Tsai M Y，et al. Associations between two common polymorphisms in the ABCA1 gene and subclinical atherosclerosis:Multi－Ethnic Study of Atherosclerosis［J］. Atherosclerosis，2007，193(2):352－360.

［13］ Huang Y，Wu Y，Liu R，et al. Differential effect of ATP binding cassette transporter A1 R219K and cholesteryl ester transfer protein TaqIB genotypes on HDL－C levels in overweight/obese and non－obese Chinese subjects［J］. Acta Cardiol，2011，66(2):231－237.

［14］ Oram J F，Lawn R M.ABCA1:the gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol［J］. J Lipid Res，2001，42(8):1173－1179.

［15］ Jiang Z，Zhou R，Xu C，et al. Genetic variation of the ATP－binding cassette transporter A1 and susceptibility to coronary heart disease［J］. Mol Genet Metab，2011，103(1):81－88.

［16］ Li Y，Tang K，Zhou K，et al. Quantitative assessment of the effect of ABCA1 R219K polymorphism on the risk of coronary heart disease［J］. Mol Biol Rep，2012，39(2):1809－1813.

［17］ Li Y Y，Zhang H，Qin X Y，et al. ATP－binding cassette transporter A1 R219K polymorphism and coronary artery disease in Chinese population:a meta－analysis of 5，388 participants［J］. Mol Biol Rep，2012，39(12):11031－11039.

［18］ Li J，Wang L F，Li Z Q，et al. Effect of R219K polymorphism of the ABCA1 gene on the lipid－lowering effect of pravastatin in Chinese patients with coronary heart disease［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(5－6):567－570.

［19］ Tsai M Y，Ordovas J M，Li N，et al. Effect of fenofibrate therapy and ABCA1 polymorphisms on high－density lipoprotein subclasses in the Genetics of Lipid Lowering Drugs and Diet Network［J］. Mol Genet Metab，2010，100(2):118－122.