陳偉珠，晉文慧，洪專，*，張怡評，方華，易瑞灶

（1.國家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源化學與化工中心，福建 廈門 361005；2.廈門大學化學化工學院化學系，化學生物學福建省重點實驗室，福建 廈門 361005）

二 十 碳 五 烯 酸（cis-5，8，11，14，17-eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，DHA），屬于ω－3 系高度不飽和脂肪酸，其中EPA 被譽為“血管清潔劑”，DHA被稱為“腦黃金”。EPA 和DHA 是人體難以合成，需由食物供給的必需脂肪酸，是理想的功效食品或營養(yǎng)品。研究表明[1-2]，EPA、DHA 與人體許多生命現(xiàn)象有關，對維護人體健康有重要作用，目前廣泛應用于各種保健食品中。EPA、DHA 都為人體所必需的脂肪酸，主要來自于海洋魚類，難以從一般食物中加以補充。當前市場上魚油產品層出不窮，深受消費者歡迎，但是由于產地、加工工藝等原因，其有效成分EPA、DHA含量存在較大差異，因此迫切需要建立起測定EPA、DHA 含量的快速有效的方法。由于EPA 和DHA 不穩(wěn)定，一般是做成酯類，通常采用乙酯化[3]。目前，關于二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）的檢測技術，文獻報道的大多數(shù)都采用常規(guī)的高效液相色譜方法[4-5]、液質聯(lián)用法[6]和氣相色譜方法[7]，運行一個樣品需要10 min 以上。近年來，隨著商品化亞2 μm 填料的逐步推廣，構建超高壓液相色譜系統(tǒng)（UPLC）及其分析方法已經成為分析化學領域研究的熱點之一。UPLC 是指一種采用小粒徑填料色譜柱（＜2 μm）和超高壓系統(tǒng)（＞105kPa）的新型液相色譜技術，可顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究，已有很多文獻報道[8-13]。但目前國內外尚未見有關超高壓液相色譜在魚油中EPA-EE和DHA-EE 檢測的相關報道。本文擬采用超高壓液相系統(tǒng)建立起檢測魚油中EPA-EE 和DHA-EE 的快速、靈敏的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

超高壓液相色譜儀配TUV 檢測器：ACQUITY，美國Waters公司；ACQUITYUPLCTMBEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）：美國Waters 公司；Milii-Q 超純水純化系統(tǒng)：美國Millipore 公司；百萬分之一分析天平：德國梅特勒公司。

1.2 試劑與材料

DHA-EE、EPA-EE：美國Sigma-Aldrich 公司；粗魚油：國內某產家提供；乙腈：色譜純，美國天地有限公司；實驗用水為Milli-Q 超純水。

1.3 實驗條件

1.3.1 標準溶液的配制

分別精密稱定EPA-EE 對照品13.041 mg 和DHA-EE 對照品12.914 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成EPA-EE 和DHAEE 儲備液（當天使用），使用時用甲醇逐級稀釋成系列標準溶液。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEHC18（2.1mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-水（80∶20，體積比）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220nm，進樣量3μL，柱溫：30℃。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇與優(yōu)化

對于液相色譜而言，流動相的組成和配比對物質分離的影響顯著?？疾炝艘约状?水與乙腈-水分別為流動相時的分離效果。在乙腈-水流動相中，EPA-EE與DHA-EE 分離效果較好，繼續(xù)再調整乙腈與水的比例，比較了乙腈的比例分別為75%、80%和85%時對分離效果的影響（如圖1 所示）。

由圖1 可見，當流速同為0.5 mL/min 時，乙腈-水（75∶25，體積比）、乙腈-水（80∶20，體積比）和乙腈-水（85∶15，體積比）這3 種流動相，EPA-EE 與DHA-EE的都能達到基線分離，達到分析要求，尤其以乙腈-水（75∶25，體積比）為流動相時效果最佳，分離度最大，但是綜合考慮運行時間和分析，選擇乙腈-水（80∶20，體積比）作為流動相。

2.2 流速的選擇與優(yōu)化

在確定乙腈-水（80∶20，體積比）為流動相后，本文進一步考察流速分別為0.3、0.4、0.5 和0.6 mL/min的分離情況。結果表明，在這幾種流速下，EPA-EE 和DHA-EE 都能完全達到基線分離，隨著流速增加，柱壓增高，保留時間縮短，如圖2 所示。綜合考慮分離度、保留時間和峰形及魚油中雜質等因素，流動相的流速定為0.5 mL/min，此時保留時間合理，峰形美觀對稱。

圖1 相同流速，相同柱溫，不同流動相下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖譜Fig.1 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in different mobile phases with the same flow rate and the same column temperature

2.3 檢測波長及柱溫的確定

檢測波長根據文獻報道[4]，選擇220 nm 為檢測波長。柱溫考察了30、35、40 ℃。實驗結果表明，在相同流動相和流速的條件下，魚油中的EPA-EE 和DHA-EE 的保留時間隨著柱溫的升高而提前（如圖3 所示）。本文考慮到EPA-EE 和DHA-EE 分離效果和實際樣品中雜質的問題，選擇柱溫為30 ℃。綜合上述的流動相、流速試驗的結果，確定色譜條件為流動相為乙腈-水（80∶20，體積比），流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm。

2.4 標準曲線、檢測限及定量限

分別精密量取EPA-EE儲備液100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μL 置于7 個5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制7 個不同濃度的標準溶液。DHA-EE 系列標準溶液，與EPA-EE 標準溶液配制方法相同，配制7 個不同濃度的標準液進樣。每個樣品進樣3 μL，按上述色譜條件測定，測定結果如表1所示。

圖2 相同流動相，相同柱溫，不同流速下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖Fig.2 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in the same mobile phases and the same column temperature with different flow rate

采用峰面積對其濃度作標準曲線，EPA-EE 線性回歸方程為y=49 273.19x+0.60（y 為峰面積，x 為樣品濃度），相關系數(shù)r=0.999 4。DHA-EE 線性回歸方程為y=14 288x-466.1（y 為峰面積，x 為樣品濃度），相關系數(shù)r=0.999 7。在各自的濃度范圍內，EPA-EE和DHA-EE 的線性關系良好，而且線性范圍較寬。逐級稀釋溶液測定檢出限、定量限，當信噪比（S/N）為3 時，EPA-EE 和DHA-EE 的檢出限分別為4 ng 和6 ng。當信噪比（S/N）為10 時，EPA-EE 和DHA-EE 的定量限分別為10 ng 和15 ng。

2.5 精密度試驗

圖3 相同流動相，相同流速，不同柱溫下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖Fig.3 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in the same mobile phases and the same flow rate with different column temperature

表1 EPA-EE 和DHA-EE 線性測定結果Table 1 Calibration curve for EPA-EE and DHA-EE

分別取EPA-EE 和DHA-EE 配制的標準溶液，濃度分別為104 μg/mL 和103 μg/mL，精密吸取3 μL 進樣，分別連續(xù)進樣6 次，考察儀器的精密度，EPA-EE和DHA-EE 的峰面積RSD 分別為1.09%和0.34%，表明本方法的精密度良好。

2.6 重復性試驗

分別取EPA-EE 和DHA-EE 儲備液，配制濃度分別為104 μg/mL 和103 μg/mL 的供試品溶液，每種樣品同一濃度分別配制6 份，精密吸取3 μL 進樣進行測定，分別計算EPA-EE 和DHA-EE 的重復性，結果EPA-EE 和DHA-EE 的重復性RSD 分別為1.54%和1.29%，表明本方法重復性良好。

2.7 回收率試驗

分別取EPA-EE 和DHA-EE 對照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解并稀釋制成每1 毫升約含EPAEE 和DHA-EE 80、100、120 μg 的溶液各3 份，作為供試品溶液進行測定，計算回收率。EPA-EE 平均回收率為102.26%，RSD 為1.33%，DHA-EE 平均回收率為96.64%，RSD 為1.05%，結果見表2。

表2 EPA-EE 和DHA-EE 回收率考察測定結果Table 2 The result of recovery for EPA-EE

表2 結果表明，本方法回收率良好。

2.8 魚油中EPA-EE 與DHA-EE 的檢測

利用本試驗所建方法對兩種魚油樣品中EPAEE、DHA-EE 含量進行檢測，并與參照國標GB/T 17377-2008《動植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》[20]規(guī)定的色譜條件測定的數(shù)據進行比較，結果見表3。

表3 測定的魚油樣品的EPA-EE、DHA-EE 含量Table 3 The content of EPA-EE and DHA-EE in Sample by two methods

由表3 的結果可看到，用本文所建立的超高壓液相方法測定國內某產家提供的兩種粗魚油的結果，與國家規(guī)定的的氣相色譜法測定的結果基本一致，但分析時間更短，操作更簡單。

3 結論

本試驗采用超高壓液相色譜法快速測定魚油中的EPA-EE、DHA-EE 含量，流動相簡單，分析時間短，一次進樣只要6 分鐘，操作簡便，定量準確，重現(xiàn)性好，此外，由于UPLC 使用填料顆粒小的短柱，柱容量較常規(guī)HPLC 小，因而檢測限也比常HPLC 低許多，可作為魚油中EPA-EE 和DHA-EE 的快速、靈敏的定量檢測方法。

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