洪 虹，馬小羽，蔡冬梅，蔣麗娟，曹翠平

糖尿病是一種在全球范圍內(nèi)高發(fā)的慢性疾病，其動(dòng)脈硬化的并發(fā)癥是導(dǎo)致死亡的主要原因之一［1］。內(nèi)皮功能障礙以內(nèi)皮細(xì)胞促氧化及促炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)為特征，是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及高血壓所共有的一種機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥反應(yīng)失調(diào)，以巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)膜上的聚集為特征。巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊上的聚集主要是由血液中粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的單核細(xì)胞衍生而來(lái)的。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是參與循環(huán)中單核細(xì)胞聚集于炎癥靶位的一個(gè)主要的趨化因子。在糖尿病患者中可以檢測(cè)到循環(huán)中MCP-1 水平的升高［2-4］。血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)是一種參與單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)的蛋白質(zhì)，其在動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病患者中亦有升高［5］。糖尿病中動(dòng)脈粥樣硬化的加速發(fā)展可以用血漿葡萄糖水平升高引起糖化蛋白與脂類相互作用而導(dǎo)致血管細(xì)胞功能的改變來(lái)解釋［6-7］。血漿蛋白中的低密度脂蛋白(LDL)在糖尿病環(huán)境中被糖基化，這種糖基化的低密度脂蛋白在糖尿病患者中的水平要高于正常對(duì)照人群［8］。氨氯地平(Amlodipine，Am)是一種二氫吡啶類L-型鈣離子通道阻滯劑，其成功地用于阻止高血脂動(dòng)物模型的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［9］，限制糖尿病高血壓患者的心血管事件的發(fā)生。本研究通過(guò)對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行糖基化低密度脂蛋白(AGE-LDL)的處理來(lái)模擬體外糖尿病合并脂代謝異常環(huán)境，通過(guò)AGE-LDL 誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，研究氨氯地平修復(fù)其功能障礙的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑 蛋白酶抑制劑、總RNA 分離試劑盒(Sigma-Aldrich 公司);cDNA 擴(kuò)增試劑(Promega公司)。氨氯地平(Am)(LKT Laboratory)。MCP-1、VCAM-1、β-actin 等的抗體及二抗(Abcam公司);莫洛尼鼠蛋白病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)(Invitrogen 股份有限公司);硝酸纖維素膜(Milipore 公司);Western Blot 印跡化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz 公司)。

1.2 低密度脂蛋白(LDL)的離析與糖基化 血漿由健康志愿者的血液中分離。天然LDL(nLDL)利用超速離心法離析。非酶促糖基化LDL(AGE-LDL)的制備通過(guò)將LDL 在37 ℃無(wú)菌條件下、在含有抗氧化劑(1 mg/mL EDTA +1 μM BHT)的0.2M D(+)葡萄糖中孵育4 周得到［10］。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HEC)來(lái)自EA. hy926 細(xì)胞株(購(gòu)自ATCC)。細(xì)胞在含有5 mM 葡萄糖和10%胎牛血清(FCS)的DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle Medium)中培養(yǎng)。匯合時(shí)，將細(xì)胞置于含有0.2% FCS的DMEM 培養(yǎng)基中饑餓，之后將細(xì)胞分為3 組:①nLDL 組，在含有100 μg 蛋白/mL nLDL 的培養(yǎng)基中孵育24 h;②AGE-LDL 組，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL 的培養(yǎng)基中孵育24 h;③AGELDL +Am 組，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL+10 μM Am 的培養(yǎng)基中孵育24 h。24 h 后收集細(xì)胞及培養(yǎng)液。

1.4 MCP-1 及VCAM-1 基因表達(dá)的定量 分離總RNA，并利用MMLV-RT 反轉(zhuǎn)錄。利用MCP-1、VCAM-1 及β-actin 的特定引物應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司StepOne Plus 系統(tǒng))進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表1，引物合成:上海博尚生物技術(shù)有限公司)。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并分析各組目的基因的OD 值。上述基因分別以nLDL 組細(xì)胞所測(cè)值的相對(duì)值表示。

表1 MCP-1、VCAM-1、β-actin 引物序列

1.5 培養(yǎng)基中MCP-1 蛋白的定量 收集三組培養(yǎng)液，分別通過(guò)Western Blot 檢測(cè)MCP-1 蛋白含量［11］。MCP-1 蛋白量用其與培養(yǎng)基中總蛋白的相對(duì)量表示，以任意單位(A.U.)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用±s 表示，計(jì)量資料比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氨氯地平對(duì)MCP-1 基因的表達(dá)及MCP-1 蛋白分泌的影響與nLDL 比較，AGE-LDL 組MCP-1 mRNA 含量升高1 倍(1.00 ±0.05 升高至2.02 ±0.27，P ＜0.01)，在AGE-LDL 中加入Am后，測(cè)得MCP-1mRNA 值明顯下降(1.40 ±0.19，30%，P ＜0.01)。見(jiàn)圖1。對(duì)培養(yǎng)基中MCP-1 蛋白相對(duì)量的分析顯示，AGE-LDL 組MCP-1 的分泌明顯高于nLDL 組，且加入Am 后，MCP-1 的分泌量明顯下降(較AGE-LDL 組下降58%，P ＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組細(xì)胞相對(duì)nLDL 組細(xì)胞的MCP-1 基因表達(dá)水平的相對(duì)值

圖2 各組培養(yǎng)基MCP-1 蛋白相對(duì)培養(yǎng)基中總蛋白值

圖3 各組細(xì)胞相對(duì)nLDL 組細(xì)胞的VCAM-1 基因表達(dá)水平的相對(duì)值

2.2 氨氯地平對(duì)VCAM-1 基因表達(dá)的影響 與nLDL 相比，AGE-LDL 組VCAM-1 mRNA 表達(dá)明顯升高(1.00 ±0.03 升至1.24 ±0.07，P ＜0.05)。而AGE-LDL 中加入Am 后，VCAM-1 mRNA 的表達(dá)明顯下降(0.77±0.06，38%，P ＜0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

糖尿病通常伴有血脂異常，血管并發(fā)癥是糖尿病主要的并發(fā)癥之一。脂代謝異常、高血糖、胰島素抵抗、糖基化血紅蛋白等在其發(fā)病過(guò)程中均起重要作用。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是指蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒(méi)有酶參與的條件下，自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)所生成的穩(wěn)定共價(jià)物，該反應(yīng)過(guò)程稱為非酶促糖基化反應(yīng)(Maillard 反應(yīng))。AGEs 可通過(guò)直接或間接的方式對(duì)機(jī)體多個(gè)組織和器官產(chǎn)生病理作用。高糖、氧化應(yīng)激等狀態(tài)下機(jī)體AGE 可形成加速，血清AGEs 濃度可明顯升高［12］。本實(shí)驗(yàn)即利用AGE-LDL 模擬高糖及血脂異常環(huán)境，研究其對(duì)內(nèi)皮功能的影響。

有研究表明，炎性因子MCP-1 可促進(jìn)血液中單核細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜，促發(fā)血管內(nèi)膜炎性反應(yīng)［13］。亦有研究表明，VCAM-1 是啟動(dòng)動(dòng)脈硬化早期炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)單核細(xì)胞遷移和滲透的關(guān)鍵步驟［14］。AGE 可通過(guò)激活NF-κB 誘發(fā)血管內(nèi)膜炎性反應(yīng)［15］。本研究顯示，AGE-LDL 可上調(diào)MCP-1 及VCAM-1 的表達(dá)，促進(jìn)MCP-1 的分泌，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

Ca2+是生物體內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，主要作為細(xì)胞信使傳遞胞外信號(hào)，是多種受體激動(dòng)后信息傳遞的中心環(huán)節(jié)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高，可觸發(fā)細(xì)胞許多生命活動(dòng)過(guò)程。You 等［16］研究指出，AGE 作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，能增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，并通過(guò)Ca2+-NF-κB 途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。氨氯地平作為第三代鈣離子拮抗劑，已廣泛應(yīng)用于高血壓患者的降壓治療當(dāng)中［17-23］。本研究顯示，與AGE-LDL 比較，經(jīng)Am + AGELDL 處理后的內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 及VCAM-1 的表達(dá)明顯下降，MCP-1 的分泌亦明顯降低。表明氨氯地平可下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 及VCAM-1基因的表達(dá)，在糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的血管內(nèi)皮功能障礙方面具有一定的修復(fù)及保護(hù)作用。

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