龍光艷 劉 梅 王建華 李娜娜 陳 玲*

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，呼吸醫(yī)學(xué)研究室，遵義 563003）

甲型流感患者CD4和CD8因子的變化及其臨床意義

龍光艷 劉 梅 王建華 李娜娜 陳 玲*

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，呼吸醫(yī)學(xué)研究室，遵義 563003）

目的檢測(cè)甲型流感患者外周血CD4及CD8因子，了解CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義。方法收集年齡在20～55周歲之間有明顯流感病毒感染癥狀患者的鼻咽拭子，將經(jīng)流感病毒NP基因片段鑒定確診的甲型流感患者作為研究對(duì)象，分別于感染后不同時(shí)間段采取外周血，離心取血清，應(yīng)用雙抗體夾心技術(shù)（ELISA）測(cè)定流感患者血清中CD4及CD8因子進(jìn)行檢測(cè)及分析。結(jié)果經(jīng)ELISA檢測(cè)，顯示經(jīng)流感病毒NP基因檢測(cè)確診的4例甲型流感患者中，所有病例CD4、CD8因子在感染3天時(shí)均呈下降或下降趨勢(shì)，在感染7d時(shí)表達(dá)水平逐漸升高；從表達(dá)水平觀察，CD4因子表達(dá)水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達(dá)。結(jié)論流感病毒感染人體后可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞水平的改變，在感染初期1～3d，CD4及CD8因子呈下降或下降趨勢(shì)，提示CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞功能受到不同程度的抑制；在感染7～14d，CD4及CD8因子表達(dá)逐漸升高并可達(dá)高峰值，可能參與病毒的清除，在引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

ELISA；T淋巴細(xì)胞；CD4；CD8；流感病毒

近年來，由于新的流感病毒重組變異株的出現(xiàn)，給世界衛(wèi)生造成實(shí)質(zhì)性的威脅，其中包括2009年的H1N1流感病毒株[1]。甲型H1N1流感病毒基因組由禽流感、豬流感和人流感病毒基因混合而成，是一種新型病毒，并且人類普遍易感[2]。中國(guó)衛(wèi)生部數(shù)據(jù)顯示，截止2010年1月2日中國(guó)地區(qū)確診的H1N1病例為12.094萬人，死亡病例為659人[3]。流感疫情暴發(fā)的形式越來越復(fù)雜，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注。

在流感病毒感染時(shí)，體液免疫和細(xì)胞免疫在疾病的嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸上都可能發(fā)揮著重要的作用[4]。構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞主要有T、B淋巴細(xì)胞，但機(jī)體對(duì)抗病毒感染主要是特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，人體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是由T淋巴細(xì)胞各亞群的比例來進(jìn)行調(diào)節(jié)和維持的[5]。T淋巴細(xì)胞亞群包括CD4+T和CD8+T，CD4+T細(xì)胞的主要功能是輔助抗體的應(yīng)答，而CD8+T細(xì)胞是抗流感病毒細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。在流感病毒感染的急性期，CD4+和CD8+T細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)肺部炎癥變化，提示著CD4+和CD8+T可能與流感病毒感染密切相關(guān)。本課題用ELISA法對(duì)流感患者感染不同時(shí)間的外周血CD4、CD8進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，了解CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

選擇2010年10月至2011年2月本院門診確診為流感的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱、咽痛、流涕、鼻塞、咳嗽、咯痰、頭痛、全身酸痛、乏力；部分病例出現(xiàn)嘔吐和/或腹瀉；少數(shù)病例僅有輕微的上呼吸道癥狀，無發(fā)熱；體征主要包括咽部充血和扁桃體腫大。

1.2 儀器和試劑

酶標(biāo)儀（BIO-RAD，iMark，美國(guó)）；CD4酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒（10-25-695）及CD8酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒（10-25-696）均為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品。

表1 CD4、CD8在流感患者不同時(shí)間的表達(dá)水平（χ—±s，μg/L）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的流感患者鼻咽拭子進(jìn)行病毒RNA的提取及擴(kuò)增、鑒定；鼻咽拭子甲型流感病毒NP基因片段PCR擴(kuò)增，凝膠電泳。

NP引物序列：NP-F：5'-AGAGGATGGTGCTTTCTGC-3'NP-R：5'-CCA TCATTCTTATAACTTCTG-3'；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：Step1（1cycle）：95℃2min， Step2（41cycles）： 95℃20S，55℃ 20S，68℃ 1min30S，Step3（1cycle）；68℃7min。

外周靜脈血采集：經(jīng)鼻咽拭子流感病毒核蛋白NP基因片段鑒定后的患者，在感染3d、7d、14d及2月后（自身正常對(duì)照，記為0天）用EDTA處理的采血管分別采取外周血，每次3mL，以3000g離心10min，取上清保存于-80℃冰箱中備用。

流感病毒患者血清CD4及CD8細(xì)胞因子檢測(cè)：嚴(yán)格按儀器和酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書操作。統(tǒng)計(jì)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ—±s）表示。

2 結(jié) 果

2.1 采集流感樣癥狀患者鼻咽拭子12份（男性5份，女性7份，年齡20～55歲）。

2.2 12份標(biāo)本經(jīng)甲型流感病毒NP基因鑒定，篩查出甲型流感病例4例（病例1，2，3，4）。

2.3 血清CD4及CD8細(xì)胞因子表達(dá)情況

經(jīng)ELISA檢測(cè)，病例1、病例4CD4在感染3d時(shí)均呈下降或下降趨勢(shì)，4例患者在感染7～14d CD4表達(dá)水平有不同程度的升高；其中病例2、病例3及病例4在感染7d CD4的表達(dá)水平較高，而病例1在感染14d CD4表達(dá)水平較高。病例1及病例4 CD8在感染3d時(shí)均表達(dá)下降，4例患者在感染7～14d CD8表達(dá)水平有不同程度的升高；其中病例2及病例3在感染7d時(shí)CD8的表達(dá)水平較高，而病例1及病例4在感染14d CD8表達(dá)水平較高。從表達(dá)水平觀察，CD4因子表達(dá)水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達(dá)。病例1 CD4及CD8分子在感染3d時(shí)均表達(dá)下降，感染7d逐漸上升，均在感染14d表達(dá)達(dá)高峰。病例2及病例3 CD4及CD8分子均在感染7d表達(dá)達(dá)高峰。病例4 CD4及CD8分子在感染3d時(shí)均表達(dá)下降，感染7d逐漸上升，其中CD4在在感染7d表達(dá)達(dá)高峰，而CD8在感染14d時(shí)表達(dá)達(dá)高峰，見表1。

3 討 論

成熟的T細(xì)胞表達(dá)CD4或CD8分子，即CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。CD4和CD8分子的主要功能是輔助TCR識(shí)別抗原和參與T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)外周血中C D4及CD8的變化，判斷CD4+和CD8+細(xì)胞在流感患者中的表達(dá)情況。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)感染豬流感H1N1亞型病毒5～6d時(shí)CD4+T、CD8+T細(xì)胞可達(dá)高峰值[5]；但在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究大多數(shù)認(rèn)為流感患者存在T淋巴細(xì)胞亞群免疫功能障礙，彭華保等人[6]研究顯示流感患者病程初期（1～3d）CD4+T、CD8+T表現(xiàn)為抑制狀態(tài)；并認(rèn)為，病情越重T淋巴細(xì)胞亞群的抑制越明顯，恢復(fù)期明顯上升[6-7]。其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為在流感感染初期CD4+T細(xì)胞呈下降的，之后逐漸升高。本研究顯示，確診的4例甲型流感患者中，從表達(dá)水平觀察，CD4因子表達(dá)水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達(dá)。所有病例CD4、CD8因子在感染1～3d時(shí)均呈下降或下降趨勢(shì)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示著甲型流感患者早期淋巴細(xì)胞亞群功能即受損表現(xiàn)為全面抑制狀態(tài)；4例病例在隨著病情的恢復(fù)在感染7～14d，CD4及CD8因子表達(dá)逐漸升高并可達(dá)高峰值，提示可能參與病毒的清除，在引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并且外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化對(duì)估計(jì)病情的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后具有重要的作用。4例病例CD4及CD8表達(dá)最高值的時(shí)間不同，可能與患者的病程進(jìn)展不同有關(guān)。Annette Fox[8]等人研究顯示，CD8+T細(xì)胞的激活應(yīng)答和分化應(yīng)答是不同的，在輕型流感患者中其表達(dá)是快速、短暫的和適度的，但在重癥流感患者中其表達(dá)延遲和/或過度的，其研究中60%的重癥流感患者CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于正常值范圍，而其他患者其CD8+T計(jì)數(shù)值有表達(dá)在正常范圍內(nèi)的、也有高表達(dá)以及過度表達(dá)的。提示著CD8

+T在甲型流感患者中的表達(dá)可能與病情的嚴(yán)重程度有關(guān)，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？傊?，本研究顯示，流感感染可導(dǎo)致CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平的改變，提示著流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群可能在流感病程中發(fā)揮著重要作用。流感病毒與T淋巴細(xì)胞亞群相互關(guān)系的進(jìn)一步研究，對(duì)流感的診斷、治療和預(yù)后估計(jì)有重要的臨床意義。

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R373.1+3

B

1671-8194（2013）11-0076-02

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)基金(黔省專合字2010-68)

*通訊作者：lingjuncd@163.com