李愛華，高斌，賀克武，程繼新，肖衛(wèi)華

最近報道球形的金納米顆粒（gold nanorods，GNRs）對腫瘤細胞放療具有一定的增敏作用［1-3］，可以利用金納米探針靶向結合腫瘤細胞，聯合125I粒子的放射活性殺死腫瘤細胞，以減少125I粒子植入所需的處方劑量，同時可達到完全適形、均勻殺傷腫瘤細胞，并保護正常細胞免受放射線損傷。金納米棒聯合125I粒子組織間植入治療腫瘤，將會為臨床防治腫瘤開辟一條新的途徑。本文報道選用二氧化硅作為殼材，制備橢球形二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）。

1 材料與方法

1.1 葉酸耦聯GNRs＠SiO2的合成與表征

1.1.1 GNRs＠SiO2的制備采用誘導晶種生長法，按參考文獻［4］，在反應溶液中加入一定量的GNRs晶種，在表面活性劑分子作用下，GNRs定向生長為具有一定軸比的金納米棒。取10 ml制備好的金納米棒溶液以1.2×104g離心2次，棄上清液，然后將底物超聲分散在10 ml超純水中。滴加氨水，調溶液pH值為10。然后向瓶中加入10 mmol／L正硅酸乙酯的乙醇溶液2 ml，劇烈磁力攪拌24 h。將二氧化硅包覆的金納米棒進行離心收集，先后用去離子水和無水乙醇各洗2次。最后，將制備好的納米復合材料超聲分散在無水乙醇中。

1.1.2 GNRs＠SiO2的表面氨基化在制備好的GNRs＠SiO2乙醇溶液中，加入氨基丙基三甲氧基硅烷（3-APTS）乙醇溶液后混勻，80℃恒溫磁力攪拌反應4 h。收集溶液，先后用無水乙醇和去離子水各離心洗滌2次，每次15 min，棄上清液，將所得底物超聲分散在超純水中。

1.1.3 葉酸耦聯GNRs＠SiO2先將N-羥基丁二酰亞胺（NHS）0.1 mg、二氯乙烷（EDC）2 mg以及0.2 mg葉酸加入500μl去離子水中混勻避光旋轉反應1 h，將葉酸的羧基活化后，加入制備好的GNRs＠SiO2-NH2水溶液20 ml，避光旋轉反應24 h。以1×104g離心洗滌2次，每次15 min，收集溶液，棄上清液。將底物葉酸耦聯的GNRs＠SiO2（GNRs＠SiO2-FA）超聲分散在5 ml超純水中備用。

1.1.4 表征用透射電鏡觀察所制備GNRs的大小、形態(tài)和結構；用可見紫外吸收光譜檢測二氧化硅包覆前后金納米棒光學性質的變化以及葉酸偶聯二氧化硅包覆后的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA）的紫外吸收圖譜。

1.2 GNRs＠SiO2-FA的生物相容性檢測

采用HepG2肝癌細胞株（購自上海細胞庫），將細胞在加有10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至合適時間。取對數生長期細胞（長滿皿底面積約80%時），消化后調節(jié)細胞濃度為5 000個/ml，以100μl/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度（金元素濃度為25×10-6，12.5×10-6，5×10-6，2.5×10-6，0.5×10-6）GNRs＠SiO2-FA的RPMI 1640培養(yǎng)液100μl。細胞繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中孵育24、48 h后，分別加入5 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μl，置于搖床上低速振蕩15 min，使結晶物充分溶解，在酶標儀490 nm波長吸光度處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（細胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO），每組設5個復孔。實驗重復3次，取平均值分析。細胞存活率=（實驗組吸光強度均值/陰性對照吸光強度均值）×100%。

1.3 透射電鏡觀察GNRs＠SiO2-FA進入細胞過程

取對數生長期的HepG2細胞，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液洗3次。實驗組加入RPMI 1640培養(yǎng)液9 ml和GNRs＠SiO2-FA溶液1 ml，對照組加入10 ml RPMI 1640培養(yǎng)液，培育1、4、12、24 h后終止培養(yǎng)，胰酶消化收集細胞，將細胞混懸液放入50 ml離心管離心（1 000 g）6 min，將細胞團聚物重溶于PBS液，移至2 ml Ep管中，離心（800 g）4 min，棄上清液。加入1.5 ml的2.5%戊乙醛前固定，4℃下1%鋨酸后固定2 h，乙醇-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，透射電鏡下觀察、照椎。

1.4 熒光染料羅丹明標記

將羅丹明異硫氰酸酯（RBITC）溶于乙醇中，加入氨基化的GNRs＠SiO2-FA溶液中，混合溶液pH值調至9.0，RBITC與GNRs＠SiO2-FA表面的氨基基團室溫下反應，12 h后離心洗滌3次，將納米顆粒重懸于無水乙醇中，即得到羅丹明標記的GNRs＠SiO2-FA。

1.5 激光共聚焦顯微鏡成像

將滅菌處理的蓋玻片放入6孔板中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將對數生長期的HepG2細胞濃度調節(jié)至5×104個孔，接種在6孔板中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，加入羅丹明標記的GNRs＠SiO2-FA共培養(yǎng)2 h，以未加羅丹明標記的GNRs＠SiO2-FA作為對照。移出培養(yǎng)液.用RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗細胞3次，室溫下用細胞固定液固定細胞10 min，再用PBS液沖洗。在載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅的封片液，蓋上蓋玻片封片，用萊卡激光共聚焦顯微鏡成像（CLSM，德國，雙光子系統）。

2 結果

2.1 表征

通過透射電鏡表征，可觀察到制備出的二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）呈橢球形（圖1）。金納米棒呈棒狀位于中心，二氧化硅包覆于其表面。

圖1電鏡下橢球形SiO2包覆GNRs

圖2 是金納米棒和GNRs＠Si O2以及GNRs＠Si O2-FA的紫外吸收圖譜，可見金納米棒有2個特征吸收峰，分別位于516 nm和712 nm處；而包覆橢球形二氧化硅后的金納米棒（GNRs＠SiO2）的2個特征吸收峰位于516 nm和714 nm處。通過紫外吸收圖譜檢測發(fā)現，二氧化硅包覆金納米棒前后的特征吸收峰位置基本沒有改變，表明二氧化硅殼層對金納米棒進行表面修飾以后，光學特性沒有改變。

圖2 GNRs、GNRs＠SiO2和GNRs＠SiO2-FA的紫外吸收圖譜

同時可見，葉酸偶聯二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA）吸收峰除了金納米棒的特征吸收峰外，在282 nm處出現了1個新的吸收峰，這與葉酸的吸收峰位置一致。

2.2 二氧化硅包覆的金納米棒的生物相容性檢測

圖3是不同濃度GNRs＠SiO2-FA對HepG2細胞的毒性測定結果，可見細胞存活率均大于87%，毒性為0～1級，屬于對細胞的無毒范疇。說明在一定濃度范圍內表面修飾的納米探針對HepG2細胞體外培養(yǎng)生物安全性較好。

圖3 不同濃度GNRs＠SiO2-FA對HepG2細胞毒性測定

2.3 細胞攝取GNRs＠SiO2-FA過程

電鏡下可見GNRs＠SiO2-FA能以納米顆粒形式通過細胞吞噬方式進入細胞。同時發(fā)現進入細胞后，GNRs＠SiO2-FA橢球型形狀沒有遭到破壞。細胞吞噬GNRs＠SiO2-FA的速度較快，在與細胞接觸1 h后，觀察到已有GNRs＠SiO2-FA與細胞膜接觸，細胞伸出偽足；4 h后，有更多的GNRs＠SiO2-FA與細胞膜接觸，并有膜樣結構的吞噬泡形成，細胞質中有少量的GNRs＠SiO2-FA；12 h后，見細胞質內大量GNRs＠SiO2-FA，部分靠近細胞核邊緣，細胞核內未見GNRs＠Si O2-FA。24 h后，有的GNRs＠Si O2-FA已與細胞核膜接觸，但GNRs＠SiO2-FA依然主要存在于細胞質內，細胞核內未見GNRs＠Si O2-FA。見圖4。

圖4 GNRs＠SiO2-FA與HepG2細胞培養(yǎng)不同時間的電鏡下所見

3.4 激光共聚焦顯微鏡成像

用激光共聚焦顯微鏡熒光檢測GNRs＠SiO2-FA的細胞攝取過程，可見經過RBITC修飾的GNRs＠SiO2-FA發(fā)射543 nm的紅色熒光，細胞照片結果表明，GNRs＠SiO2-FA可攜帶熒光探針進入細胞內，同時發(fā)現GNRs＠SiO2-FA在HepG2細胞質內分布較多，而其在細胞核內分布較少，見圖5。

圖5 GNRs＠SiO2-FA細胞攝取的激光共聚焦顯微鏡成像

3 討論

金納米棒是一種棒狀的GNR，具有獨特的光學特性，在可見光區(qū)和近紅外區(qū)，具有橫向和縱向表面等離子體共振峰（SPR）［5-6］，金納米棒還具有較好的生物適應性，表面容易被抗體、生物素、寡核苷酸、酶等探針分子功能化［7-8］。金納米棒可吸收近紅外激光并轉化為熱能釋放到局部環(huán)境，這種光熱效應在疾病的治療中具有重要的應用價值。文獻報道金納米的周圍溫度在納秒范圍內可達到1 000℃［9］。

晶種生長法是金納米棒合成最廣的一種方法。此方法需用大量表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）覆蓋在金納米棒的表面維持金納米棒的穩(wěn)定，而CTAB具有較強的生物毒性［10］。另外，由于CTAB吸附雙層分子的存在，金納米棒表面很難與其他生物分子相結合［11］，這就限制了金納米棒在生物醫(yī)學領域的應用。因此，尋求一種較好的金納米棒表面化學修飾方法，將為金納米棒在生物醫(yī)學領域的應用開辟更好的發(fā)展前景。

納米二氧化硅無毒性，生物相容性較好，具有優(yōu)良的透光性，對包覆后的金納米棒光吸收性能影響較?。?2-13］。葉酸在腫瘤細胞膜表面高度表達，而在絕大多數正常組織中幾乎不表達［14］，所以葉酸作為靶向配體可與葉酸受體過度表達的癌細胞結合。如何將葉酸與金納米棒結合是目前國內外研究的熱點問題。本研究選用二氧化硅作為殼材，制備橢球形二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）。并用硅烷耦聯劑和二氧化硅耦聯，使其表面帶有大量氨基，將葉酸聯接到二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA），用RBITC與GNRs＠SiO2-FA表面的氨基基團反應，得到羅丹明標記的GNRs＠SiO2-FA。所制備的材料有良好的生物相容性，解決了傳統的金納米棒合成過程中因使用穩(wěn)定劑而產生的細胞毒性［15-16］。應用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現金納米棒能夠運載熒光染料進入細胞。

本文成功地制備出一種橢球形核-殼結構二氧化硅包覆的金納米復合材料，提高了金納米棒的穩(wěn)定性和分散性，細胞安全性實驗證明，表面修飾后的金納米棒有良好的生物相容性，透射電鏡圖像觀察到金納米顆粒以細胞吞噬的方式進入細胞的過程；激光共聚焦顯微鏡圖像表明，GNRs＠SiO2-FA能攜帶熒光探針進入細胞內，可用于負載熒光染料對細胞進行成像。GNRs＠SiO2-FA可作為熒光試劑或其他生物標記物的載體，廣泛應用于疾病診斷或治療，特別是能與葉酸高表達的癌細胞靶向結合，使其在腫瘤的125I粒子介入治療方面有很好的發(fā)展前景。

［1］Zhang X，Xing JZ，Chen J，et al.Enhanced radiation sensitivity in prostate Cancer by gold-nanoparticles［J］.Clin Invest Med，2008，31：E160-E167.

［2］Liu C，Wang CH，Chien CC，et al.Enhanced x-ray irradiationinduced cancer cell damage by gold nanoparticles treated by a new synthesis method of polyethylene glycol modification［J］.Nanotechnology，2008：19：295104.

［3］Yang DP，Cui DX.Advances and prospects of Gold nanorods［J］.Chem Asian J，2008，3：2010-2022.

［4］Pan B.End-to-end self-assembly and colorimetric characterization of gold nanorods and nanospheres via oligonucleotide hybridization［J］.Nanotechnology，2005，16：1776-1780.

［5］Eustis S，E1-Sayed MA.Why gold nano-particles are more preciousthan pretty gold：noble metalsurface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes［J］.Chem Soc Rev，2006，35：209-217.

［6］Liz-Marzán LM.Tailoring surface plasmons through themorphology and assembly of metal nanoparticles［J］.Langmuir，2006，22：32-41.

［7］Tong L，Wei Q，Wei A，et al.Gold nanorods as contrast agents for biological imaging：optical properties，surface conjugation and photothermal effects［J］.Photochem Photobiol，2009，85：21-32.

［8］馬占芳，田樂，邸靜，等.基于金納米棒的生物檢測、細胞成像和癌癥的光熱治療［J］.化學進展，2009，21：134-142.

［9］Huettmann G.Model system for investigating laser-induced subcellular microeffects［J］.2001.

［10］Connor EE，Mwamuka J，Gole A，et al.Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity［J］.Small，2005，1：325-327.

［11］Mirska D，Schirmer K，Fnari SS，et al.Colloids surf［J］.B，2005，40：51-59.

［12］Chen ZL，Sun Y，Huang P，et al.Studies on preparation of photosensitizer loaded magnetic silica nanoparticles and their Anti-Tumor effects for targeting photodynamic therapy［J］.Nanoscale Res Lett，2009，4：400-408.

［13］Xie C.Preparation of a novel amino functionalized fluoresceindoped silica nanoparticle for pH probe［J］.Nano Biomed Eng，2009，1：37.

［14］田慧，張奇，項光亞，等.葉酸受體介導的腫瘤靶向治療研究進展［J］.中國臨床藥理學雜志，2006，22：227-229.

［15］Wang CG，Chen Y，Wang TT，et al.Gold nanorods embedded silica particles as Raman label for immunoassay［J］.Adv Funct Mater，2008，18：355-361.

［16］Wang CG，Ma ZF，Wang TT，et al.Synthesis，assembly，and biofunctionalization of silica-coated Gold nanorods for colorimetric biosensing［J］.Adv Funct Mater，2006，16：1673-1678.