董衍明，黃玉，彭建新，李毅,2

1 華中師范大學生命科學學院昆蟲所，湖北 武漢 430079 2 武漢生物工程學院生物工程系，湖北 武漢 430079

Human ParvovirusB19 (HPVB19)，簡稱 B19病毒，屬于細小病毒科 (Parvoviridae)，細小病毒病毒亞科 (Densovirinae)，紅細胞病毒屬(Erythrovirus)，是目前為止僅有的兩種能感染人類的細小病毒科成員之一[1]。B19病毒作為一種重要病原，能夠引起多種疾病，如：第五疾病、兒童傳染性紅斑、急性再障現象、胎兒水腫、孕婦關節(jié)炎和自然流產、血小板減少性紫癜以及急性肝炎[2-4]。

B19病毒基因組為單鏈線性DNA分子，長約5 596 bp，兩端為長約386 nt的長末端反向重復序列 (ITRs)[5]。病毒粒子為無包膜，二十面體結構，其衣殼由VP1 (84 kDa) 及VP2 (58 kDa)兩種結構蛋白組成[6]。NS1 (72 kDa) 作為其主要的非結構蛋白，是一個重要的多功能蛋白，能引起細胞凋亡、激活細胞內多種炎性因子的表達，并且對于病毒DNA的復制是必要的[7-10]。另外，在非結構基因編碼區(qū)還存在兩種由小 mRNA編碼的小蛋白7.5 kDa和11 kDa[11]。已有的研究發(fā)現11 kDa蛋白能夠影響病毒粒子的出核、誘發(fā)細胞凋亡，特異結合生長因子受體結合蛋白(Grb2)，推測其可能通過干擾細胞內信號通路引起B(yǎng)19病毒相關疾病[12-14]。而對于7.5 kDa蛋白在病毒復制和感染過程中具體發(fā)揮什么作用，目前還不清楚。

核轉錄因子 NF-κB廣泛存在于各種類型的真核細胞中，其活性受細胞胞漿內多種蛋白質家族成員的調控，共同構成 NF-κB系統(tǒng)，包括NF-κB/Rel家族、IκB蛋白家族和 IKK蛋白家族[15]。在正常生理條件下，NF-κB在胞漿中與 IκB抑制蛋白相結合，處于非活化狀態(tài)，當細胞受到外界刺激時，IκB-α構象發(fā)生改變，發(fā)生泛素化降解，NF-κB被掩蓋的核定位信號暴露，并進入細胞核，啟動下游相關基因的表達，從而完成NF-κB信號途徑的激活[16]。

為了研究11 kDa蛋白對細胞內NF-κB信號通路的影響，我們通過原核表達與純化得到11 kDa融合蛋白，制備了多克隆抗體，并在Hela細胞內驗證了其主要呈胞漿定位，同時通過熒光素酶檢測及 Western blotting證實了其對于細胞內NF-κB信號通路的誘導。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及細胞

質粒 pGEX-KG、pcDNA3.1(-)、pGL3-Basic、pNF-κB-luc，E. coliDH5α/BL21(DE3)菌株，HeLa細胞由本實驗室保存；B19病毒感染性克隆pB194244由加拿大 INRS-Institute Armand-Frappier的Tijssen教授贈送。

1.2 主要試劑及引物

各種工具酶均購自TaKaRa公司；DNA片段膠回收試劑盒、高純度質粒小提中量試劑盒購自Tiangen公司；蛋白marker購自Fermentas公司；轉染試劑jetPEI Reagent購自Polylus公司；熒光素酶檢測試劑盒 (Luciferase Assay System) 購自Promega公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自 Wisent公司；BAY11-7082、LPS、DAPI、多聚甲醛購自碧云天生物技術公司；Dylight488標記羊抗鼠購自艾美捷生物技術公司；所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 11 kDa原核和真核表達載體的構建

以B19病毒感染性克隆pB194244為模板，P1、P2互為引物，PCR擴增非結構蛋白基因11 kDa，PCR產物經BamHI/HindIII雙酶切，與經同樣酶切的原核表達載體pGEX-KG連接。以P3、P4為引物，PCR獲得的11 kDa-HA融合基因經XhoⅠ/BamHⅠ酶切后插入真核表達載體pcDNA3.1(-)中。上述連接產物轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑單菌落搖菌，經PCR及酶切驗證正確后，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 11 kDa蛋白多克隆抗體的制備

將測序正確的pGEX-KG-11 kDa重組質粒轉化表達菌株E. coliBL21(DE3), 經 IPTG(0.6 mmol/L) 誘導條件下獲得的菌體裂解物，超聲破碎，12 000 r/min離心1 h，收集上清液，0.4 μmol/L 濾膜過濾雜質，GST·Bind?樹脂孵育并進行親和層析純化。BSA法測定純化后蛋白濃度，取200 μg重組蛋白GST-11 kDa加入適量完全弗氏佐劑至300 μL，背部皮下免疫BALB/c小鼠，第2次起用弗氏不完全佐劑，每隔7天加強免疫1次，共免疫4次，并于第4次免疫后1周眼球取血。

1.5 含細胞因子 IL6啟動子的熒光素酶報告質粒的構建

按照分子克隆手冊[17]的蛋白酶 K和苯酚法從Hela細胞中提取細胞基因組DNA，以提取的細胞基因組DNA為模板，P5、P6互為引物，PCR擴增IL6啟動子區(qū)片段IL6-Promoter，PCR產物經KpnⅠ/Hind Ⅲ酶切后插入含熒光素酶報告基因的載體 pGL3-Basic中，轉化挑取單克隆，經PCR和雙酶切驗證后，將陽性克隆送于上海生工生物工程有限公司測序。

表1 克隆11 kDa基因以及hIL6啟動子區(qū)的引物Table 1 Primers for cloning of 11 kDa and human IL6 promoter region

1.6 細胞培養(yǎng)與轉染

Hela細胞在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，10 000 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。轉染前一天將細胞接種于培養(yǎng)板中，細胞匯合度約為60%~70%。按照jetPEI轉染試劑操作手冊，將不同劑量的質粒轉染于細胞中。

1.7 免疫熒光檢測11 kDa蛋白在細胞內的定位

Hela細胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，將0.5 μg pcDNA3-11 kDa-HA質粒轉染Hela細胞。轉染后約48 h，使用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，然后用含0.2% TritonX-100的PBS穿孔15 min，含1% BSA的PBS室溫封閉1 h。分別加入抗11 kDa小鼠血清 (1∶1 000) 或鼠抗HA (1∶1 000) 作為一抗，37 ℃結合 2 h；PBST洗3次，每次10 min。然后加入Dylight488標記山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h；PBST洗3次，每次10 min。加入DAPI室溫避光染色15 min，PBST洗3次，熒光顯微鏡觀察11 kDa在細胞內的定位情況。

1.8 Western blotting檢測

鋪于6孔板的細胞轉染后，于48 h收集細胞，每孔細胞加入150 μL WB及IP裂解液，BSA法測定蛋白濃度，取同樣蛋白量上清樣品進行12%SDS-PAGE電泳，半干轉印法將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，然后加入一定比例稀釋的一抗，室溫結合2 h，TBST (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween20) 洗3遍，每次10 min；IRDye 800CW標記的山羊抗兔或小鼠二抗 (1∶5 000)，室溫結合45 min，TBST洗3遍，每次10 min，于 Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描采集圖像。

1.9 熒光素酶檢測11 kDa蛋白對NF-κB轉錄活性及細胞因子IL6啟動子活性的影響

接種Hela細胞于24孔板中，將含熒光素酶基因的報告質粒 pNF-κB-luc，pGL3-IL6-P-luc(0.20 μg) 分別與pcDNA3-11 kDa-HA及空載體pcDNA3.1 (0.20 μg) 共轉染Hela細胞，轉染后12 h，更換新鮮正常培養(yǎng)基，陽性刺激組加入LPS(100 ng/mL) 刺激；抑制組加入 NF-κB 抑制劑BAY 11-7082 (20 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h，裂解并收集細胞上清，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 B19病毒11 kDa蛋白的純化及抗體制備

將酶切并測序正確的重組質粒 pGEX-KG-11 kDa轉化E.coliBL21(DE3)，經 IPTG(0.6 mmol/L) 誘導條件下獲得的菌體裂解物，10% SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色后，在相對分子質量38 kDa附近有目的蛋白條帶表達(圖1A)。經Western blotting驗證確為目的融合蛋白GST-11 kDa (結果未給出)。蛋白誘導表達成功后，大規(guī)模誘導并收集菌體，菌體經過超聲破碎，12 000 r/min離心1 h，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測發(fā)現目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中，經 GST樹脂親和層析純化后于目的條帶處獲得單一的目的蛋白GST-11 kDa (圖1B)。接著按照1.4方法，成功制備小鼠源多抗血清。

2.2 B19病毒11 kDa蛋白的細胞定位

圖1 11 kDa蛋白的原核表達及純化Fig. 1 Expression and purification of 11 kDa protein. (A) Expression of GST-11 kDa protein in E. coli BL21(DE3). M：unpaged protein marker; 1： expression of empty control vector induced by IPTG; 2： expression of recombinant plasmid un-induced by IPTG; 3： expression of recombinant plasmid induced by IPTG. (B) Purification of 11 kDa protein in E. coli BL21(DE3). M： unpaged protein marker; 1： empty control vector induced by IPTG; 2： recombinant plasmid induced by IPTG; 3： purified protein.

圖2 11 kDa蛋白在Hela細胞內的定位Fig. 2 Cellular localization of 11 kDa proteins in transfected Hela cells. (A) and (C)： Hela cells were transfected with empty vector pcDNA3.1; (B) and (D)：Hela cells were transfected with pcDNA3-11 kDa-HA.

為了探究11 kDa蛋白在細胞內的定位，我們將成功構建的 pcDNA3-11 kDa-HA真核表達質粒 (0.5 μg)，按照jetPEI Reagent操作說明書，轉染入Hela細胞中，48 h后，利用anti-HA抗體及GST-11 kDa抗鼠血清作為一抗，免疫熒光法檢測pcDNA3-11 kDa-HA轉染組的11 kDa蛋白的表達情況。結果顯示，HA抗體和11 kDa抗鼠血清兩組免疫熒光的結果一致，11 kDa蛋白在Hela細胞內均主要呈胞漿分布，該結果與 Chen等在UT7/Epo-S1細胞中的結果一致[13]。

2.3 B19病毒11 kDa蛋白對NF-κB轉錄活性的影響

NF-κB (核轉錄因子) 是細胞內的主要調控因子，尤其在病毒感染過程中起著重要的作用。鑒于 11 kDa的細胞質定位，推測其可能參與NF-κB信號通路的調控，為此，我們首先檢測了11 kDa蛋白對 NF-κB轉錄活性的影響。將pcDNA3-11 kDa-HA (0.5 μg) 和 pNF-κB-luc(0.25 μg) 共轉染 Hela細胞，空載體 pcDNA3.1作為對照，熒光素酶檢測發(fā)現，陽性刺激組中LPS (100 ng/mL) 能顯著上調NF-κB轉錄活性。與對照組相比，11 kDa蛋白能上調細胞內NF-κB的轉錄活性，同時利用 NF-κB的抑制劑 BAY 11-7082 (20 μmol/L) 能夠顯著抑制其活性的上調。此結果說明B19病毒11 kDa蛋白能激活細胞內NF-κB的轉錄活性 (圖3)。

圖3 11 kDa蛋白對細胞內NF-κB轉錄活性的影響Fig. 3 Effect of 11 kDa protein on the transcription activity of NF-κB. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3).

2.4 B19病毒11 kDa蛋白引起IκB-α的降解

在 NF-κB信號通路激活的過程中會伴隨著IκB-α 的降解，為了研究11 kDa是否能誘導 IκB-α的降解，我們將 pcDNA3-11 kDa-HA和空載體pcDNA3.1各1 μg分別轉染Hela細胞，于48 h收集細胞樣品，BSA法測定蛋白濃度，按照1.8中 Western blotting方法，分別用 anti-HA/p65/IκB-α/β-actin為一抗檢測細胞總蛋白中的 11 kDa、IκB-α、p65及 β-actin。結果所示，11 kDa蛋白成功得到了表達，與對照組相比，p65亞基含量保持一致，而細胞中IκB-α的含量明顯降低，表明11 kDa蛋白的表達導致細胞漿中IκB-α發(fā)生了降解 (圖 4)。

2.5 B19病毒11 kDa蛋白對細胞因子IL6啟動子的調控作用

為了研究11 kDa蛋白能否誘導細胞炎性因子IL6的產生，我們將含IL6啟動子的熒光素酶報告質粒pGL3-IL6-P-luc (0.1 μg) 與真核表達質粒pcDNA3-11 kDa-HA (0.5 μg) 共轉染 Hela細胞，同時設空載體對照，48 h后收集細胞樣品，通過熒光素酶報告系統(tǒng)檢測11 kDa對IL6啟動子活性的影響。結果顯示，與空載體相比，11 kDa激活IL6啟動子活性提高了2倍 (P＜0.05)。同時，為了探究11 kDa對IL6的激活是否依賴于NF-κB信號通路的活化，在同樣的共轉染條件下，12 h后使用 20 μmol/L特異性抑制劑BAY11-7082處理細胞，48 h收集細胞樣品并檢測熒光素酶活性，結果顯示11 kDa激活IL6啟動子的能力下降了80% (圖5)。這表明，11 kDa激活的細胞因子IL6是部分依賴于NF-κB信號通路的。

圖4 11 kDa蛋白引起IκB-α的降解Fig. 4 11 kDa protein induced the degradation of IκB-α.

圖5 11 kDa蛋白上調IL6啟動子的活性Fig 5 11 kDa protein up-regulate the activity of IL6 promoter. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3).

3 討論

機體在遭受外界病原感染及刺激時能通過識別相關分子模式引發(fā)機體相應的免疫應答反應，而NF-κB信號通路的誘導活化在此過程中發(fā)揮了重要的作用，其主要是通過誘導激活下游的免疫及炎性相關因子的轉錄表達[15]。已有研究表明病毒相關蛋白也可激活或者調節(jié)細胞內的NF-κB信號途徑。如EB病毒編碼的LMP1蛋白及HCV編碼的核心蛋白X能通過活化NF-κB維持持續(xù)性感染[18-19]。B19病毒編碼的NS1蛋白能激活細胞內TNF-α的大量表達，其過程主要是依賴于NF-κB信號途徑[20]。而作為B19病毒的另外一個小非結構蛋白11 kDa蛋白質是否具有相應的生物功能，目前還不清楚。

本研究通過 NF-κB熒光素報告質粒檢測發(fā)現 11 kDa能顯著刺激細胞內 NF-κB的轉錄，Western blotting檢測表明 11 kDa能通過誘導IκB-α的降解從而激活核轉錄因子 NF-κB。在實驗中我們還通過免疫熒光方法檢測了p65的核轉運過程，發(fā)現部分表達了11 kDa蛋白的細胞發(fā)生了p65的入核現象，推測其由于該過程的發(fā)生較短暫，導致很多入核現象難以檢測 (該部分結果未給出)。已有的研究表明，各種外界刺激因子誘導NF-κB信號通路中的下游途徑基本相同，但上游信號傳遞方式卻是不同的。目前了解比較清楚的上游信號途徑主要有TNFR、TLRs、IL-1R以及RIG/MDA5介導的NF-κB的活化[16]。在實驗中我們還發(fā)現通過共轉染含 TNF-α啟動子的熒光素酶報告質粒及11 kDa真核表達質粒，檢測到TNF-α啟動子的顯著性表達 (數據未給出)，因此我們推測11 kDa激活NF-κB信號通路的上游途徑主要是通過其誘導的 TNF-α激活信號蛋白TRAF2從而激活NF-κB的。

NF-κB所調節(jié)的大量炎性因子和趨化因子，包括 IL6、IL8、CXCL1等在自身免疫性疾病及許多炎性疾病中發(fā)揮重要的作用[21-22]。本文中通過熒光素酶報告檢測系統(tǒng)發(fā)現11 kDa能夠上調細胞內IL6啟動子活性，由于B19病毒能夠引起顯著的自主性免疫疾病，已有的報道認為其誘因主要是NS1蛋白激活的IL6及TNF-α等細胞因子以及細胞對 NS1產生的過多的特異性抗體對其自身造成的損傷影響。鑒于11 kDa在誘導細胞凋亡過程中起著比NS1更重要的作用，而我們的結果也顯示11 kDa能夠激活IL6的表達，推測11 kDa蛋白在B19病毒引起機體自主性免疫疾病方面可能起著與 NS1類似的功能。在實驗中，我們同樣觀察到11 kDa能明顯誘導Hela細胞凋亡。已有研究表明NF-κB主要通過誘導下游抗凋亡基因的表達抑制細胞凋亡[23]；然而也有研究表明NF-κB的激活與細胞凋亡密切相關[24-28]。因此，我們推測11 kDa蛋白引起Hela細胞凋亡與NF-κB的激活可能相關，其具體機制有待進一步的研究?？傊?，探究B19病毒11 kDa非結構蛋白在誘導NF-κB信號途徑中的作用，將為研究B19病毒與宿主細胞的相互作用提供新的思路和方向，具有重要的意義。

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