葛偉,唐曦,歐陽鋼,莫非,侯立皓,婁青林,顧劉寶

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電針對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠腸黏膜鈣結(jié)合蛋白-D9k mRNA和蛋白表達(dá)的影響

葛偉1,唐曦2,歐陽鋼1,莫非1,侯立皓1,婁青林1,顧劉寶1

(1.江蘇省省級機(jī)關(guān)醫(yī)院,南京 210024;2.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016)

觀察電針對去卵巢大鼠模型腸黏膜鈣結(jié)合蛋白-D9k(CaBP-D9K)mRNA和蛋白表達(dá)的影響,探討針灸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能機(jī)制。將60只3月齡SD健康雌性大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組,3個月造模成功后將手術(shù)組隨機(jī)分為模型組、假電針組、電針組、藥物組。干預(yù)治療12星期后,測定腰椎及股骨骨密度(BMD),然后處死大鼠,提取小腸黏膜,采用熒光實時定量PCR和Western blotting檢測CaBP-D9K mRNA和蛋白表達(dá)。成功復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型,經(jīng)電針組和藥物組干預(yù)治療12星期后,其大鼠骨密度與模型組相比均有明顯提高,熒光實時定量PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示電針組和藥物組大鼠小腸黏膜CaBP-D9K mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),但電針組上調(diào)CaBP-D9K mRNA的水平不及藥物組。針灸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥機(jī)制之一可能與上調(diào)小腸黏膜CaBP-D9K mRNA和蛋白表達(dá)量,從而增強腸鈣吸收有關(guān)。

針刺療法;電針;骨質(zhì)疏松癥,絕經(jīng)后;鈣結(jié)合蛋白-D9k;大鼠

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是臨床上中老年女性的一種常見病、多發(fā)病,其發(fā)病原因有很多,研究證實,婦女絕經(jīng)后的骨量快速丟失,除外因絕經(jīng)后所致的雌激素下降外,鈣及維生素D等營養(yǎng)物質(zhì)的生物可用性低,腸鈣吸收障礙也是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生的重要原因之一[1-2]。筆者前期的研究證實針灸對骨質(zhì)疏松癥有良好的治療效果[3-4],針灸的治療效果是否是通過增強機(jī)體的脾胃功能,從而提高了機(jī)體內(nèi)鈣及維生素D等營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度,為此筆者觀察了針刺對去卵巢大鼠模型腸黏膜鈣結(jié)合蛋白-D9k(CaBP-D9K)mRNA和蛋白表達(dá)的影響,從分子水平探討針刺防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備

韓氏電針儀由南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司提供; Discovery-A骨密度儀由美國HOLOGIC公司提供;高速離心機(jī)由德國Eppendorf公司提供;Model680酶標(biāo)儀由美國伯樂公司提供;0.20 mm×13 mm針灸針由無錫佳健醫(yī)療器械有限公司提供;164-5051型Western電泳儀由美國Bio-Rad公司提供。

1.2 藥物與試劑

苯甲酸雌二醇注射液由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),規(guī)格為1 mg/mL;TRIzol試劑和BBI第一鏈cDNA合成試劑盒購自invitrogen公司,引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司設(shè)計并合成;CaBP-D9K試劑盒購自Thermo Scientific公司。引物序列設(shè)計如下,CaBP-D9K基因上游: 5'-GATAAGAACGGTGATGGAGAAGT-3';CaBP-D9K基因下游:5'-TCAATCAGTAGGTGGTGTCGG-3';探針: 5'-CAAAAAGTTATCACAATGAAGCCAGAA-3';GAPDH對照基因上游:5'-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3';GAPDH對照基因下游:5'-CCAGTAGACTCCACGACATACTCA-3',探針: 5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'。

1.3 動物造模

用3%戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉后,于背部正中切口進(jìn)入腹腔背側(cè),完整摘除雙側(cè)卵巢后,仔細(xì)止血,逐層縫合。假手術(shù)組取腰椎旁背側(cè)切口,進(jìn)入腹腔,切除一段小腸系膜后,立即止血縫合。動物手術(shù)后給予抗生素3 d,防止感染,自由攝食,飲水。3個月后進(jìn)行骨密度檢測確定造模是否成功[5]。

1.4 分組及治療方法

選取60只3月齡Sprague Dawley(SD)雌性清潔級大鼠,體重為180～200 g。未曾交配,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗動物使用許可證號為SCXK(滬)2007-0005。動物適應(yīng)飼養(yǎng)1星期后,隨機(jī)分成A、B兩組,其中A組為假手術(shù)組,共15只,不切除雙側(cè)卵巢;B組為實驗組,共45只,切除雙側(cè)卵巢。3個月后進(jìn)行骨密度檢測確定造模成功后,兩組各取5只摘除眼球取血后處死,提取骨標(biāo)本保存。將A組余下的10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組;B組余下的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、假電針組、電針組和藥物組,每組10只。

1.4.1 電針組

造模成功后,大鼠不作麻醉,在自己設(shè)計的鼠架上進(jìn)行針灸操作。取穴分兩組,①關(guān)元、三陰交(雙);②腎俞、后三里(雙)。每日選取其中一組穴位,二組穴位交替進(jìn)行,取穴方法按華興邦的方法實施,用細(xì)美容針刺入穴位后,接韓氏電針儀進(jìn)行電針刺激,其刺激參數(shù)為連續(xù)脈沖波,頻率為3～4 Hz,強度為4～5 mA,以動物局部輕度抖動為度,每次20 min。每日1次,連續(xù)治療3個月。

1.4.2 假電針組

穴位和針刺操作同電針組,連接電針儀但不打開電針儀開關(guān)。

1.4.3 藥物組

造模成功后,按人鼠劑量換算,每只大鼠每次以0.1 mg/kg皮下注射苯甲酸雌二醇,每3 d注射1次,連續(xù)治療3個月。

1.4.4 假手術(shù)組

同模型組不作任何處理。

5組大鼠治療3個月后進(jìn)行骨密度的檢測,處死大鼠,摘除眼球取血,分離血清,置于﹣20℃冰箱保存集中待測。提取小腸黏膜于﹣70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 骨密度

大鼠處死前應(yīng)用美國產(chǎn)HOLOGIC Discovery-A骨密度儀及所附小動物梯級標(biāo)準(zhǔn)模型和分析軟件在體掃描,計算出大鼠全身及腰椎及股骨的骨密度。

1.5.2 小腸黏膜標(biāo)本取樣

采用5%苯巴比妥鈉麻醉大鼠,腹部常規(guī)消毒后,打開腹腔,從十二指腸起始端剪下約10 cm小腸,無菌生理鹽水沖洗干凈后,剪刀縱行剪開腸腔,用烤過的載玻片刮下腸黏膜,置于Trizol中,另一部分,用錫鉑紙包裹,迅速置于盛有液氮的容器中,﹣70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 Real time-PCR檢測CaBP-D9K mRNA

①總RNA提取。在小腸黏膜組織中加1 mL Trizol充分勻漿;加入0.2 mL氯仿,4℃離心后取上清,加入0.5 mL異丙醇離心后加入1 mL75%乙醇,洗滌沉淀, ﹣20℃保存?zhèn)溆?②cDNA合成。取5mL RNA加入5mL DEPC水,再加入1mL Random Primer p(dN)6,70℃水浴5 min,立即置于冰中。逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系為ddH2O 11mL,5×Buffer 4.0mL,dNTP 2.0mL, RNasin 1.0mL,AMV 2.0mL。置RT反應(yīng)體系依次于37℃水浴5 min,42℃水浴60 min,70°C水浴10 min后將標(biāo)本置﹣20℃保存。③熒光定量PCR。GAPDH作為內(nèi)參,PCR反應(yīng)體系為ddH2O 9mL,2×HS qPCR Master Mix 12.5mL,上下游引物各0.5mL,Taq酶0.5mL,標(biāo)本cDNA模板2.0mL。反應(yīng)條件為95℃ 2 min, 95℃ 10 s,60℃ 40 s,40個循環(huán)。④PCR結(jié)果采用2-K法代表基因的相對表達(dá)倍數(shù),ΔΔCT法為A=CT(目的基因,待測樣本)－CT(內(nèi)參基因,待測樣本);B=CT(目的基因,對照樣本)－CT(內(nèi)參基因,對照樣本)。K=A－B。

1.5.4 Western blotting檢測CaBP-D9K蛋白

在小腸黏膜組織中加入400mL裂解液,充分裂解后4℃離心,﹣70℃保存?zhèn)錂z。將純化的蛋白樣品在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠80 V 30 min,分離膠100 V 90 min;電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。用含有5%脫脂奶粉Tris緩沖液封閉4℃過夜;加入抗CaBP-D9K抗體(1:400)后4℃過夜;洗膜后加入1:5000稀釋的HRP二抗,室溫孵育2 h;洗膜后曝光顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析。以＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型判斷

大鼠雙側(cè)卵巢摘除3個月后,模型組大鼠腰椎和股骨的骨密度較假手術(shù)組明顯降低,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),提示骨質(zhì)疏松模型造模成功。詳見表1。

表1 兩組造模后腰椎和股骨體骨密度比較(±s,g/cm2)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.O5

2.2 各組治療后股骨近端及腰椎體BMD比較

電針組治療后腰椎骨密度與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。藥物組和非手術(shù)組治療后腰椎及股骨骨密度與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組治療后腰椎骨密度與藥物組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),提示藥物組提高大鼠腰椎骨密度效果優(yōu)于電針組。詳見表2。

表2 各組治療后股骨近端及腰椎體骨密度比較 (±s,g/cm2)

注:與模型組比較1)＜0.O5;與藥物組比較2)＜0.O5

2.3 電針刺激對大鼠小腸黏膜CaBP-D9K mRNA表達(dá)的影響

表3 各組治療后小腸黏膜CaBP-D9K mRNA表達(dá)及CaBP-D9K蛋白表達(dá)比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.O1;與藥物組比較2)＜0.O1

電針組、藥物組和假手術(shù)組治療后小腸黏膜組織CaBP-D9K mRNA表達(dá)及CaBP-D9K蛋白表達(dá)與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組治療后小腸黏膜組織CaBP-D9K mRNA表達(dá)與藥物組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。詳見表3。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因有很多,大量的流行病學(xué)和研究均證實,婦女絕經(jīng)后的骨量快速丟失,除外因絕經(jīng)后卵巢功能下降而導(dǎo)致雌激素水平下降外,腸鈣吸收障礙是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生的重要原因之一[1-2]。腸鈣吸收是一個復(fù)雜的生理、生化過程,它包括被動擴(kuò)散過程和主動跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運過程。正常情況下,腸道鈣吸收以主動轉(zhuǎn)運為主,也就是需要腸道的CaBP-D9K協(xié)助。CaBP-D9K是一種受活性維生素D調(diào)節(jié)的機(jī)體內(nèi)鈣的重要轉(zhuǎn)運蛋白,分子量為9000,其含量高低直接影響到鈣、磷吸收代謝,進(jìn)而影響骨骼發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)小腸上皮細(xì)胞內(nèi)CaBP含量與腸鈣吸收量呈正相關(guān),因此普遍認(rèn)為CaBP-D9K在腸鈣吸收過程中起著重要作用[6]。鈣進(jìn)入細(xì)胞主要是通過細(xì)胞膜上鈣通道,順電化學(xué)梯度而進(jìn)行。進(jìn)入胞漿后,鈣結(jié)合蛋白馬上與進(jìn)入的鈣離子結(jié)合,促進(jìn)鈣離子從刷狀緣膜側(cè)向基底膜轉(zhuǎn)運亦即跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運,加快鈣離子在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散,從而促進(jìn)鈣離子在小腸的吸收[7]。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大多為中老年患者,隨著年齡的增長,其消化吸收功能呈逐年下降的趨勢[8],腸黏膜組織中CaBP隨著年齡增加也緩慢下降,臨床研究證實70歲時腸鈣吸收率較青年時期減少近50%,這也是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥高發(fā)原因之一[9],因此提高腸黏膜組織中CaBP的活性和含量,從而提高腸鈣吸收率對防治骨質(zhì)疏松癥具有非常重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎主骨,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與腎虛有密切關(guān)系,另外,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者消化吸收功能下降主要是由于脾胃虛弱,化生水谷精微功能下降所致,鑒于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者多有脾腎俱虛的病理特點,筆者在臨床上多選用具有補腎健脾作用的腎俞、關(guān)元俞、足三里、三陰交等為主的腧穴進(jìn)行針灸治療,在臨床上收到較好效果[1-2],因此本實驗選用關(guān)元、三陰交、腎俞、后三里4個腧穴,對通過去卵巢建立的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型進(jìn)行針灸干預(yù),結(jié)果顯示,與模型組相比較,電針組能明顯提高模型大鼠的骨密度(＜0.05),表明針灸療法具有良好的抗骨質(zhì)疏松癥的作用。另外在本研究中,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型與假手術(shù)組大鼠比較,其小腸黏膜組織CaBP-D9K表達(dá)明顯下降,與文獻(xiàn)報道[10]結(jié)果一致。電針組與模型組比較,大鼠小腸黏膜組織CaBP-D9K基因和蛋白表達(dá)均明顯提高,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。由于CaBP-D9K是促進(jìn)腸鈣吸收的重要物質(zhì),在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中具有重要作用,據(jù)此筆者推測,針灸良好的抗骨質(zhì)疏松癥的作用可能是通過增強小腸黏膜組織CaBP-D9K基因和蛋白表達(dá),提高了鈣及其它營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度,從而增強了胃腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能實現(xiàn)的。另外,筆者在本課題研究中設(shè)計了假電針組以觀察非常規(guī)的針灸治療是否對骨質(zhì)疏松癥模型大鼠產(chǎn)生影響,結(jié)果表明假電針組大鼠小腸黏膜組織CaBP-D9K基因和蛋白表達(dá)有一定的提高,但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05),表明針灸治療取效需要達(dá)到一定的刺激量才有可能產(chǎn)生效果。

[1] Pignotti GA, Genaro PS, Pinheiro MM,. Is a lower dose of vitamin D supplementation enough to increase 25 (OH)D status in a sunny country?[J]. Eur J Nutr, 2009,49(5):277-283.

[2] Obermayer-Pietsch BM, Gugatschka M, Reitter S,. Adult-type hypolactasia and calcium availability: decreased calcium intake or impaired calcium absorption?[J]. Osteoporos Int, 2007,18(4):445- 451.

[3] 歐陽鋼,王玲玲,卓鐵軍,等.不同刺激方法對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥骨密度的影響[J].中國針灸,2004,24(1):49-50.

[4] 歐陽鋼,王東巖,徐小梅.針灸配合藥物治療男性骨質(zhì)疏松癥療效觀察[J].中國針灸,2011,31(1):23-25.

[5] 吳啟躍,馬雯,余正紅,等.骨質(zhì)疏松兩種造模方法的對照研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2007,15(8):17-19.

[6] Song Y, Kato S, Fleet JC. Vitamin D receptor (VDR) knockout mice reveal VDR-independent regulation of intestinal calcium absorption and ECaC2 and calbindin D9k mRNA[J]. J Nutr, 2003,133(2):374- 380.

[7] Schroeder B, Dahl MR, Breves G. Duodenal Ca2﹢absorption is not stimulated by calcitriol during early postnatal development of pigs [J]. Am J Physiol, 1998,275(2):305-313.

[8] Kalu DN, Chen C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption[J]. J Bone Miner Res, 1999,14(4):593-601.

[9] 孟迅吾.鈣與骨質(zhì)疏松癥[J].中華內(nèi)科雜志,2005,44 (3):235-236.

[10] van Abel M, Hoenderop JG, van der Kemp AW,. Regulation of the epithelial Ca2﹢channels in small intestine as studied by quantitative mRNA detection[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003,285(1):78-85.

Effect of Electroacupuncture on the Expressions of CaBP-D9K mRNA and Protein in Intestinal Mucosa in a Rat Model of Postmenopausal Osteoporosis

1,2,1,1,-1,-1,-1.

1.,210024,; 2.,400016,

To investigate the effect of electroacupuncture on the expressions of calcium binding protein-D9k (CaBP-D9K) mRNA and protein in intestinal mucosa of ovariectomized rats and explore a possible mechanism for acupuncture treatment of postmenopausal osteoporosis.Sixty 3-month-old healthy female SD rats were randomly allocated to operation and sham operation groups. Following successful model making after 3 months, the operation group was randomly allocated to model, sham electroacupuncture, electroacupuncture and medication groups. Lumbar vertebral and femoral bone mineral density (BMD) was measured after 12 weeks of interventional treatment. The rats were then sacrificed. Small intestinal mucosa was taken. The expressions of CaBP-D9K mRNA and protein were examined using real time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.A model of postmenopausal osteoporosis was made successfully. After 12 weeks of interventional treatment, bone mineral density was increased significantly in the electroacupuncture and medication groups compared with the model group. The results of measurement using real time fluorescence quantitative PCR and Western blotting showed that the expressions of CaBP-D9K mRNA and protein in small intestinal mucosa were up-regulated in the electroacupuncture and medication groups of rats, but the level of up-regulation of CaBP-D9K mRNA was lower in the electroacupuncture group than in the medication group.One of the mechanisms of acupuncture treatment for postmenopausal osteoporosis may be that up-regulated expressions of CaBP-D9K mRNA and protein in small intestinal mucosa increase intestinal absorption of calcium.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Osteoporosis, Postmenopausal; Calcium binding protein-D9k; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.11.944

1005-0957(2013)11-0944-04

國家自然科學(xué)基金項目(81072850)

葛偉(1983 - ),男,住院醫(yī)師

歐陽鋼(1966 - ),男,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,E-mail:oygang@sina.com.cn

2013-07-26