陳 華，蔣李懿，喬鳴芳，資云玲，李風(fēng)舟

（廣東省口腔醫(yī)院黏膜科，廣州 510280）

念珠菌是廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的條件致病菌，其中引起人類念珠菌疾病的主要是白色念珠菌，又稱白色假絲酵母菌（candida albicans，CD）。 正常人CD 的帶菌率以口腔為最高。近年來，隨著各種抗腫瘤化療藥物、免疫抑制劑、皮質(zhì)激素和廣譜抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及器官移植、介入治療的不斷實(shí)施，口腔CD 感染的發(fā)病率呈不斷上升趨勢［1-2］。 T 細(xì)胞免疫在抗CD 感染的過程中起著非常重要的作用, Th1 /Th2 比例的失調(diào)，有利于CD 病的發(fā)展。 IL-12 是連接天然免疫和獲得性免疫的一個(gè)重要紐帶，又是促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子。 樹突狀細(xì)胞 （dendritic cell,DCs）可產(chǎn)生IL-12，是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，也是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者［3］。 在系統(tǒng)性真菌感染中，Th1 類因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫對(duì)機(jī)體起了保護(hù)作用，故測定抗原提呈細(xì)胞識(shí)別捕捉抗原后分泌IL-12 水平的高低是判斷免疫應(yīng)答方向的有效指標(biāo)［4］。本研究觀察了DCs 受CD 抗原沖擊后分泌IL-12 的變化，初步探討DCs 在抗CD 感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠4 只，雌雄不拘，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：HNASLKJ20101432，清潔環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與藥物

沙保瓊脂培養(yǎng)基（sabourd’s dextrose agar，SDA，廣州迪景微生物科技公司），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）及RPMI-1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），青霉素、鏈霉素溶液和紅細(xì)胞裂解液（上海玉博生物科技有限公司），重組小鼠細(xì)胞因子GM-CSF（rGM-CSF）和重組小鼠細(xì)胞因子IL-4（rIL-4，美國R&D 公司），小鼠IL-12 ELISA 試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓DCs 的制備與培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)［5-6］的方法，制備與培養(yǎng)小鼠骨髓DCs，其具體步驟：1）將C57BL/6 小鼠斷頸處死，浸泡于碘伏液中消毒5 min；2） 無菌條件下取后肢雙側(cè)股骨、脛骨，浸泡于500 U·mL-1雙抗（青霉素和鏈霉素）PBS 中，剔凈周圍組織，洗凈后離斷干骺端，用注射器針頭破壞骨小梁后，用無血清1640 反復(fù)抽吸、沖洗髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液；3）將所得細(xì)胞懸液過200 目鋼網(wǎng)，吹打成單細(xì)胞懸液；4）將單細(xì)胞懸液離心、棄上清，加0.5 mL 紅細(xì)胞裂解液重懸，于室溫下靜置5 min，加無血清1640 稀釋，離心、洗滌2 遍；5） 用DC 誘導(dǎo)體系 ［RPMI-1640+10%FBS+rGM-CSF（20 ng·mL-1）+rIL-4（20 ng·mL-1）］定容制成細(xì)胞懸液，調(diào)至細(xì)胞濃度為1×107mL-1，置24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL；置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6）3 d 后，吸棄懸浮細(xì)胞，加入同體系培養(yǎng)液，1 mL·孔-1，顯微鏡下可見細(xì)胞長出樹突樣突起，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液。

1.3.2 CD 菌株和鑒定

從廣東省口腔醫(yī)院黏膜牙周科確診的20 例口腔念珠菌病患者的唾液中分離出CD 菌株，SDA 培養(yǎng)，經(jīng)念珠菌CHROM agar 鑒定，45 ℃生長實(shí)驗(yàn)，玉米吐溫80 培養(yǎng)基培養(yǎng)和念珠菌API 20C AUX 鑒定保種。

1.3.3 CD 菌株擴(kuò)增

CD 菌株用SDA 28 ℃培養(yǎng)48 h， 菌液濃度調(diào)至5×105mL-1，轉(zhuǎn)種于YPD 液體培養(yǎng)基，調(diào)至5×105mL-1，置搖床150 r·min-1、25 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，離心棄上清，將菌液濃度調(diào)至1×108mL-1，加入含F(xiàn)BS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基，菌液濃度調(diào)至為5×105mL-1，置37 ℃水浴箱培養(yǎng)3 h，得到即為菌絲相CD。

1.3.4 CD 對(duì)DCs 的沖擊實(shí)驗(yàn)及分組

待上述DCs 培養(yǎng)6～7 d，收取漂浮的DCs,調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106mL-1， 以2 倍于DCs 的細(xì)胞數(shù)加入CD，每孔1 mL 置6 孔培養(yǎng)，共同置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。 分2組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：DCs+CD 組和DCs 組。 DCs+CD 組每孔中加入CD，使其終濃度為1×107mL-1，DCs 與CD 的比例為1∶10；置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4、12 及24 h 后分別取出培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液, 2 000 r·min-1離心2 min 后，取上清液。 DCs 組不加CD，DCs 細(xì)胞培養(yǎng)4、12 及24 h 后分別取出培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液，2 000 r·min-1離心2 min后， 取上清液。 均采用ELISA 法檢測上清液中細(xì)胞因子IL-12。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

DCs 組的DCs 有少量的IL-12 分泌，隨著時(shí)間的推移，有緩慢增多的趨勢。 培養(yǎng)到4 h 時(shí)，2組的IL-12 濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.42，P＞0.05）。培養(yǎng)12、24 h 時(shí)，DCs+CD 組分泌的IL-12 濃度分別為（150.12±56.38）和（1 236.24±125.33）ng·L-1，顯著高于DCs 組的（93.65±29.18）和（347.56±76.54）ng·L-1（t=3.978，t=32.837，均P＜0.05）。 見表1。

表1 2組各時(shí)間段DCs 分泌IL-12濃度的比較 ，ρ/（ng·L-1）

3 討論

口腔念珠菌病是人類最常見的口腔真菌感染，引起口腔念珠菌病最常見的是CD［1］。 CD 具有亞硝基化潛力，在口腔黏膜白斑向口腔癌轉(zhuǎn)變的過程中起到了促進(jìn)作用［7］。 因此，對(duì)CD 感染的研究越來越多。

DCs 是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。正常情況下，體內(nèi)絕大多數(shù)DC 處于未成熟狀態(tài)，這時(shí)它具有較強(qiáng)的抗原呈遞能力。 目前從多種組織中已能分離誘導(dǎo)出具有正常功能的DC，而不同來源以及處于不同發(fā)育階段DC 具有不同的生物學(xué)特征［8］。 1992 年，Reid 等［9］在骨髓細(xì)胞中鑒定出DCs 的造血干細(xì)胞克隆，并且在GM-CSF 和TNF-α 的共培養(yǎng)下它能分化成DCs 及巨噬細(xì)胞。由于骨髓來源方便，且DCs 前體細(xì)胞的含量亦相對(duì)較多，因此在隨后的研究中成為應(yīng)用較多的DCs 來源［6］。 本實(shí)驗(yàn)采取小鼠骨髓體外培養(yǎng)、細(xì)胞因子rGM-CSF 和rIL-4 細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培育的方法，以IL-4 阻止巨噬細(xì)胞發(fā)育生長，從而獲得了大量高純度的DCs。

DC 可分泌IL-12、NO 及IFN-C 等，調(diào)節(jié)CD4+Th細(xì)胞向Th1 型分化。 Th1 型細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答, 可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能, 增加機(jī)體對(duì)CD 的抵抗力。IL-12 是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答中的基本介質(zhì)，也是測定CD 免疫的核心指標(biāo)［10］。 本實(shí)驗(yàn)觀察到體外培養(yǎng)的小鼠骨髓DCs 能分泌IL-12，但受CD 抗原沖擊后，DCs 分泌的IL-12 明顯高于單純DCs組，且隨著時(shí)間的推移，IL-12 分泌量逐漸增加。表明DC 在成熟過程中可以分泌IL-12，但DCs 被CD活化后IL-12 的分泌量增大。筆者推測，分泌增多的IL-12 對(duì)DC 功能的發(fā)揮可能起著至關(guān)重要的作用，在Th1 /Th2 之間的平衡調(diào)控機(jī)體免疫狀態(tài)過程中，促使Th0 分化為Th1 型細(xì)胞增多，使宿主產(chǎn)生對(duì)CD 的抵抗，這也可能是CD 致敏的DCs 能高效地誘導(dǎo)抗CD 免疫的原因之一。

［1］常東,蔣偉,黃志紅,等.真菌感染及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2005,15（3）：345-347.

［2］Pfaller M A，Jones R N，Doern G V，et al.Bloodstream infections due to candida species：SENTRY antimicrobial surveillance program in North America and Latin America，1997-1998［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000,44（3）：747-751.

［3］李寧,劉冠賢,石詠軍.樹突狀細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展［J］.西南軍醫(yī),2010,12（3）：504-506.

［4］黃巍，楊義成，黃長征,等.抗原致敏樹突狀細(xì)胞抗小鼠白念珠菌系統(tǒng)感染的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2008,22（7）：403-405.

［5］Molavi O,Mahmud A,Hamdy S,et al.Development of a poly（d，l-lactic-co-glycolic acid） nanoparticle formulation of STAT3 inhibitor JSI-124：implication for cancer immunotherapy［J］.Mol Pharmaceutics,2010,7（2）：364-374.

［6］吳昆,拜合提亞·阿扎提,王文光,等.小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)鑒定和誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞增殖［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2011,31（8）：1128-1133.

［7］Farah C S,Hong S,Wanasaengsakul S,et al.Irradiationinduced oral candidiasis in an experimental murine model［J］.Oral Microbiol Immunol,2001,16（6）：358-363.

［8］Katsnelson A.Kicking off adaptive immunity：the discovery of dendritic cells［J］.Exp Med，2006,203（7）：1622.

［9］Reid C D，Stackpoole A，Meager A，et al.Interaction of tumor necrosis factor with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines in the regulation of dendritic cell growth in vitro from early bipotent CD34＋progenitors in human bone marrow［J］.J Immunol,1992,149（8）：2681-2688.

［10］Moser M.Dendritic cells in immunity and tolerance-do they display opposite functions［J］.Immunity,2003,19（1）：5-8.