劉開友

環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CsA）是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，目前廣泛用于器官和組織移植術(shù)后的預(yù)防和治療[1]。然而CsA治療的有效血藥濃度范圍為100~450 μg/L，600 μg/L以上即有中毒危險(xiǎn)[2]，特別是肝腎毒性明顯[3]。CsA治療窗窄，個(gè)體差異大，因此，臨床應(yīng)用必須監(jiān)測其血藥濃度。本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單準(zhǔn)確的HPLC測定CsA血藥濃度的方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 CsA 標(biāo)準(zhǔn)品，乙醚，正己烷，甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），Agilent 1200型高效液相色譜儀，DiamonsilTM C18色譜柱，GENIUS 6K-D離心機(jī)，XW-80A漩渦混合儀。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取CsA標(biāo)準(zhǔn)品10.006 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為CsA標(biāo)準(zhǔn)品儲備（100 μg/mL）。用甲醇稀釋，分別配成2.5、5、10、25、50 μg/ml的CsA標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 樣品的處理

1.3.1 空白血樣 取人全血1~10 ml均塞離心管中，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，渦旋2 min，加入5 ml乙醚，渦旋5 min，3500 r/min離心10 min，取上清液4.5 ml，40 ℃水浴吹干，加入100 μl甲醇-0.05 mol/ml鹽酸（1：1，V：V）的混合液[4]，渦旋30 s，加入250 μl正己烷，渦旋2 min，3500 r/min離心5 min，棄去正己烷，取下層溶液進(jìn)樣。

1.3.2 加藥血樣 取濃度為2.5、5、10、25、50 μg/mL的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μl置10 ml均塞離心管中，分別加入人全血 1 ml，配置成含 CsA 50、100、200、500、1000 ng/ml血液樣品，加入1 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，后處理方法同“1.3.1”項(xiàng)下空白血樣。

1.4 色譜條件的選擇 色譜柱：DiamonsilTM C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（74：26）；流速：1 ml/min；柱溫：70 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.5 方法專屬性 在上述色譜條件下，分別取CsA標(biāo)準(zhǔn)液，空白血樣，加藥血樣進(jìn)行HPLC測定，考察其色譜圖。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取血藥濃度為50、100、200、500、1000 ng/ml加藥樣品進(jìn)行HPLC測定，以藥物濃度C與樣品峰（A）做線性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 回收率 配制濃度分別為50、200、1000 ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項(xiàng)下的處理方法處理、測定，分別與同濃度的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣的峰面積做比較，計(jì)算提取回收率即絕對回收率。配制濃度分別為50、200、1000 ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項(xiàng)下的處理方法處理、測定，按：“方法回收率=測得量/理論值×100%”計(jì)算方法回收率即相對回收率。

1.8 精密度 濃度分別為50、200和1000 ng/ml的加藥血樣按照“1.3.1”項(xiàng)下的處理方法處理，測定，一日內(nèi)重復(fù)操作5次，考察其日內(nèi)精密度。在隨后的5 d內(nèi)，重復(fù)操作5次，考察其日間精密度。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 CsA色譜圖考察結(jié)果如圖1所示，可見CsA的保留時(shí)間為7.6 min左右，空白血樣在此時(shí)間點(diǎn)無干擾，CsA與血液中的內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。

圖1 CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白血樣、加藥血樣的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 結(jié)果如圖2所示，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.0983C-1.629，R2=0.9997。

圖2 CsA血液內(nèi)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 回收率 低、中、高濃度的加藥血樣的提取與方法回收率見表1。低、中、高濃度的加藥血樣的日內(nèi)與日間精密度見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 %

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

個(gè)體化給藥是臨床用藥的發(fā)展趨勢，血藥濃度監(jiān)測是臨床藥學(xué)的重要任務(wù)，因此，建立高效準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)適用的CsA血藥濃度監(jiān)測方法意義重大。HPLC法已普遍應(yīng)用于CsA血藥濃度的測量[5]，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏快速，缺點(diǎn)是樣品處理繁瑣復(fù)雜，對操作人員要求高。另外，70 ℃高溫使色譜柱使用壽命縮短[6]，經(jīng)濟(jì)成本增加，但相比免疫學(xué)方法，如單克隆、多克隆熒光偏振免疫法[7-8]，酶免疫增強(qiáng)法[9]，MAb親和柱免疫測定法[10]等仍較經(jīng)濟(jì)適用。本研究中，采用HPLC法測定環(huán)孢素A血藥濃度，發(fā)現(xiàn)該方法快速靈敏準(zhǔn)確，可用于環(huán)孢素A血藥濃度的監(jiān)測。

[1]尹玉琴，李瑩，徐桂麗.骨髓移植受者環(huán)孢素A血藥濃度監(jiān)測結(jié)果分析[J].中國藥房，2009，20（11）：833-836.

[2]Carbajal H，Soltero L，Rodriguez-Montalvo C，et al. Cyclosporine and low-dose ketoconazole in renal transplant recipients： a singlecenter experience[J].Transplantation， 2004，77（1）：1038-1040.

[3]陳錦珊，杜青云.全血中環(huán)孢素A藥物濃度監(jiān)測方法評價(jià)及臨床意義[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（8）：486-487.

[4]劉葉玲，成立軍，傅孟莉.腎移植受者環(huán)孢素A血藥濃度監(jiān)測情況分析[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26（4）：308-309.

[5]謝誠，錢美英，繆麗燕.環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度監(jiān)測的質(zhì)控評價(jià)與分析[J].中國藥房，2008，19（32）：2508-2510.

[6]陳強(qiáng)，劉林.環(huán)孢菌素A的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，1995，30（11）：646-647.

[7]劉曉，張相林，張鐳，等.單克隆熒光偏振免疫法、多克隆熒光偏振免疫法和高效液相色譜法分別測定環(huán)飽素A血藥濃度結(jié)果的相關(guān)性探討[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44（10）：790-793.

[8]胡疏，王鈞，張紅宇，等.單克隆抗體放免法監(jiān)測環(huán)孢素A血藥濃度在造血肝細(xì)胞移植中的臨床價(jià)值[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，10（4）：376-378.

[9]黃成瓊，馬傳學(xué)，朱清華.EM IT法和HPLC法監(jiān)測環(huán)孢菌素A血藥濃度比較研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2009，17（2）：104-106.

[10]Li C，Lim S W， Sun B K， et al. Expression of apoptosis-related factors in chronic cyclosporine nephrotoxicity after cyclosporine withdrawal[J].Acta PharmacolSin，2004，25（1）：401-411.