劉立賓 葉華麗 胡建成 何月龍 范大鵬

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院結(jié)核實(shí)驗(yàn)室 杭州 310003

·實(shí)驗(yàn)研究·

支氣管肺泡灌洗液TB-DNA測定與其它TB檢測方法比較研究

劉立賓 葉華麗 胡建成 何月龍 范大鵬

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院結(jié)核實(shí)驗(yàn)室 杭州 310003

目的：探討支氣管灌洗液涂片染色、支氣管灌洗液培養(yǎng)及痰培養(yǎng)三種方法中結(jié)核桿菌陽性率與支氣管灌洗液結(jié)核桿菌DNA拷貝數(shù)的關(guān)系。方法：對199例確診肺結(jié)核患者分別應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）技術(shù)檢測支氣管灌洗液（BALF）結(jié)核分枝桿菌DNA（TB-DNA），并按TB-DNA拷貝數(shù)分為A（1×103～）、B（1×105～）、C（≥1×107）三組，并對所有患者行灌洗液涂片染色、灌洗液培養(yǎng)及痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌。結(jié)果：灌洗液涂片染色法A、B、C三組陽性率分別為12.0%、60.2%、92.7%，三組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），且陽性率C組＞B組＞A組；灌洗液培養(yǎng)法A、B、C三組陽性率分別為18.7%、56.6%、87.8%，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），陽性率C組＞B組＞A組；痰培養(yǎng)法A、B、C三組陽性率分別為26.7%、65.1%、82.9%，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，A組與B組、A組與C組比較P均＜0.05，B組與C組比較P＜0.05。結(jié)論：支氣管灌洗液涂片染色、灌洗液培養(yǎng)、痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌陽性率均隨支氣管灌洗液中結(jié)核桿菌DNA拷貝數(shù)遞增而增高。。

支氣管肺泡灌洗液 結(jié)核桿菌 熒光定量PCR

肺結(jié)核為全球流行性感染性疾病之一[1]，結(jié)核病的病原學(xué)檢查是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)一[2]。涂片法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，但靈敏性差，檢出率低。結(jié)核桿菌培養(yǎng)仍是目前診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是進(jìn)一步可行菌型鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，并可鑒定死菌與活菌，被譽(yù)為結(jié)核病診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核桿菌培養(yǎng)法雖特異性高，但所需時間較長[3]。熒光定量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）是近年用于臨床病原菌檢測的一種具有高靈敏性、高準(zhǔn)確性、高特異性且定量范圍寬、操作簡便、快速安全、污染最少的可靠的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)[4]。FQ-PCR法檢測支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中結(jié)核桿菌DNA（tuberculosis-DNA，TB-DNA）已成為快速診斷結(jié)核桿菌感染的一種非常有前途的方法，并被廣泛應(yīng)用到臨床[5]。我們應(yīng)用FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA，并與涂片法、培養(yǎng)法陽性率進(jìn)行比較，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年5月—2011年12月本院住院確診肺結(jié)核患者199例，年齡18～80歲，男102例，女97例。所有患者行電子支氣管鏡下集取支氣管肺泡灌洗液，并用FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA，BALF涂片找抗酸桿菌，BALF培養(yǎng)及痰培養(yǎng)。同時將研究對象按FQ-PCR檢測TB-DNA拷貝數(shù)分成A組（1×103～）75例、B組（1×105～）83例、C組（≥1×107）41例。

1.2 處理方法

1.2.1 灌洗液涂片染色法 纖支鏡檢查時于鏡下見異常者或于X線胸片∕CT異常的相應(yīng)葉段內(nèi)行支氣管肺泡灌洗，收集BALF 5mL，常規(guī)處理后，在生物安全柜中涂片，待干后經(jīng)抗酸染色，以連續(xù)觀察不少于300個不同視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為陰性，其余為陽性。

1.2.2 結(jié)核桿菌培養(yǎng)法 所有患者標(biāo)本按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢查規(guī)程》進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)。從改良羅氏培養(yǎng)基上取單個菌落，參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢查規(guī)程》的方法進(jìn)行結(jié)核桿菌鑒定。

1.2.3 FQ-PCR法 收集BALF 5mL，行FQ-PCR檢測。標(biāo)本中加入2倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min液化，液化過程中振蕩2～3次，取1mL標(biāo)本加入離心管中，12 000rpm離心5min，棄上清液留沉淀，加無菌生理鹽水1mL洗滌，10 000rpm離心5min，再重復(fù)洗滌1次，標(biāo)本加DNA提取液，于100℃15min裂解，15 000rpm離心10min。配制好PCR混合液（引物，熒光探針，MgCl2，Taq酶），將DNA模板加入PCR混合液，設(shè)陽性對照（1×104，1×106，1× 108），陰性對照。放入PCR擴(kuò)增儀，設(shè)定程序，擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 灌洗液涂片陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組灌洗液涂片陽性率分別為12.0%、60.2%、92.7%，三組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較P均＜0.05，且陽性率C組＞B組＞A組。灌洗液涂片陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數(shù)的遞增而增高，見表1。

表1 各PCR組灌洗液涂片陽性率比較 例

2.2 灌洗液培養(yǎng)陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組灌洗液培養(yǎng)陽性率分別為18.7%、56.6%、87.8%，三組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較，P均＜0.05，且陽性率C組＞B組＞A組。灌洗液培養(yǎng)陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數(shù)的遞增而增高，見表2。

表2 各PCR組灌洗液培養(yǎng)陽性率比較 例

2.3 痰培養(yǎng)陽性率 FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中，A、B、C三組痰培養(yǎng)陽性率分別為26.7%、65.1%、82.9%，三組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組間兩兩比較，A組與B組、A組與C組P均＜0.05，B組與C組P＜0.05。痰培養(yǎng)陽性率隨支氣管灌洗液FQ-PCR拷貝數(shù)的遞增而增高，見表3。

表3 各PCR組痰培養(yǎng)陽性率比較

3 討論

FQ-PCR系統(tǒng)是一密閉的DNA擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，在將擴(kuò)增體系所需各物質(zhì)加樣完畢后，即可進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測是通過系統(tǒng)對熒光探針5c端游離的R基團(tuán)熒光強(qiáng)弱的分析來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的量，當(dāng)PCR反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會擴(kuò)增出特異核酸片段，熒光探針即會根據(jù)堿基配對的原理與之雜交。PCR反應(yīng)每復(fù)制1個特異核苷酸片段，就有1個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強(qiáng)弱，即代表擴(kuò)增產(chǎn)物有無或多少[6]。由于肺泡灌洗液進(jìn)入遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔中接觸病灶范圍廣，收集量大，含菌量多，標(biāo)本充分離心沉淀。同時，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支氣管分泌物的引流[7]。故本研究選取支氣管灌洗液檢測結(jié)核分枝桿菌DNA。

已有資料[8]表明，定量PCR與病原菌數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。本研究顯示，F(xiàn)Q-PCR檢測BALF中，C組（≥1×107）灌洗液涂片染色、灌洗液培養(yǎng)、痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌陽性率明顯高于A組（1×103～）和B組（1× 105～）。因此我們認(rèn)為，臨床上分析FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液TB-DNA拷貝數(shù)可以評估其它三種方法的陽性率。FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數(shù)明顯增高時，涂片染色、灌洗液培養(yǎng)、痰培養(yǎng)的陽性率明顯增高，我們推測，此時檢測到的結(jié)核桿菌可能為活菌，細(xì)菌正處于繁殖期，或者患者可能正處于一個感染活動期。結(jié)核桿菌培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核桿菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，F(xiàn)Q-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數(shù)越高，結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性率也就越高，熒光定量PCR法隨著拷貝數(shù)的增高而無限接近這個“金標(biāo)準(zhǔn)”。反之，F(xiàn)Q-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中拷貝數(shù)值偏低時，涂片染色、灌洗液培養(yǎng)、痰培養(yǎng)的陽性率相應(yīng)地明顯降低，此時檢測到的細(xì)菌多為死菌，或結(jié)核桿菌正處于靜止期、休眠期[9]，而患者正處于潛伏感染期、輕度感染期。

綜上所述，對FQ-PCR檢測支氣管肺泡灌洗液TB-DNA拷貝數(shù)的分析可反映病原菌數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度，反映結(jié)核桿菌的繁殖情況，對鑒定死菌活菌也有一定的意義。FQ-PCR法檢測BALF中TB-DNA拷貝數(shù)，對抗結(jié)核藥物的使用的指導(dǎo)意義尚需進(jìn)一步探討。

［1］Vishnevskiiu BI，Manicheva 0A，Vishnevskaia EB，et al.The specific features of bacterial isolation and dmg resistance of Mycobacteria in extraptd monary tuberculosis［J］.Probl Tuberk Bolezn Legk（俄文），2006，11（1）：18-21．

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［8］邵俊斌，王占坤，陳智，等.實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26（8）:490.

［9］張紅漫，李志惠，趙杰，等.熒光定量PCR測定支氣管肺泡灌洗液中T bDNA對涂陰肺結(jié)核的診斷價值［J］.中國防癆雜志，2009，31（4）：227-229.

Relationship Between fluorescent quantitative-PCR Detecting Bronchoalveolar Lavage Fluid Tuberculosis DNA and other Tuberculosis detecting methods

LIU Libin, YE Huali, HU Jiancheng, et al. Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou (310003), China

Objective：To investigate the relationship between the copy number of tuberculosis-DNA(TB-DNA）in bronchoalveolar lavage fluid(BALF）by fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)and the positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training.Methods:TB-DNA in BALF from 199 definite tuberculosis patients was determined by FQ-PCR and then all samples were random ly divided into group A(1×103～）,group B（1×105～）,and group C（≥1×107）.All samples were treated with TB BALF smearing,TB BALF training,and TB sputum training.Results:In TB BALF smearing,the positive rate was significantly different in group A,B and C (12.0%,60.2%and 92.7%,respectively,P＜0.05）,with the highest in group C and the lowest in group A.The positive rate was significantly different in group A,B and C in TB BALF training(18.7%,56.6%and 87.8%,respectively,P＜0.05)and among them the difference was significant,with the highest in group C and the lowest in group A.The same result was found in TB spurum training(positive rates of group A,B and C were 26.7%, 65.1%and 82.9%,respectively).Conclusion:The positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training increased with the rise of TB-DNA copy number in BALF.

tuberculosis bronchoalveolar lavage fluid fluorescent quantitative PCR

2012-09-26