蔡丹莉 陳芝蕓 嚴(yán)茂祥 何蓓暉 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

非酒精性脂肪性肝炎形成中脂肪細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化及意義

蔡丹莉 陳芝蕓 嚴(yán)茂祥 何蓓暉 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

目的：研究非酒精性脂肪性肝炎（NASH）形成中脂肪細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化特征。方法：SD大鼠40只，隨機(jī)分成正常組10只，模型組30只；正常組大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組以高脂飼料喂養(yǎng)。模型組大鼠分別在實(shí)驗(yàn)開始后4、8、12周末3個(gè)時(shí)相點(diǎn)分批隨機(jī)處死10只，正常組全部在12周末處死。采用HE染色觀察肝組織病理組織學(xué)變化，ELISA法檢測(cè)血清及肝組織TNF-α、Leptin、IL-6、ADP水平。結(jié)果：病理組織學(xué)表明，高脂喂養(yǎng)4周大鼠表現(xiàn)為單純性脂肪肝；8周時(shí)脂肪變程度加重，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；12周時(shí)大鼠NASH形成。模型組大鼠從4周到8、12周，血清和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin水平逐漸增高，而血清ADP水平則逐漸減少；模型組4周末血及肝組織TNF-α、IL-6、Leptin、ADP水平與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而12周末血和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin、ADP水平均比正常組明顯增高或降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：脂肪細(xì)胞因子的過度表達(dá)或異常缺失參與了NASH的發(fā)生、發(fā)展。

大鼠 非酒精性脂肪性肝炎 脂肪細(xì)胞因子

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepati?tis，NASH）是一種無過量飲酒史，與脂質(zhì)和糖代謝紊亂有關(guān)的肝臟疾病。其病理組織學(xué)主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。NASH是單純性脂肪肝進(jìn)展為肝纖維化的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)。在普通人群中，NASH的發(fā)病率為3%～5%[1]，在病態(tài)肥胖人群中，其發(fā)病率可達(dá)20%～47%[2-3]。而目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞因子失衡與NASH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過高脂飲食建立大鼠NASH模型，觀察NASH形成中脂肪細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12h明暗交替，自由采食飲水。1.2 主要試劑與儀器 膽固醇（批號(hào)100208）為上海博奧生物科技有限公司產(chǎn)品，3號(hào)膽鹽（批號(hào)20100125-00）為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品，TNF-α（批號(hào) CK-E90339R）、IL-6（批號(hào) CKE306446R）、瘦素（Leptin，批號(hào)CK-E30492R）、脂聯(lián)素[Adiponectin（ADP），批號(hào)CK-E30584R]均由上海原葉生物科技有限公司提供，總蛋白測(cè)定BCA（批號(hào)20100825）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。CE2041紫外分光光度儀為英國(guó)CECIL公司產(chǎn)品，EL×800全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTeK公司產(chǎn)品，低溫高速離心機(jī)為美國(guó)THERMO Electron公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常組10只，模型組30只，后者又分4、8、12周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)。正常組大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠采用高脂飼料（10%豬油、2%膽固醇、5%蛋黃粉、0.5%3號(hào)膽鹽及82.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料）喂養(yǎng)；模型組分別在實(shí)驗(yàn)開始后第4、8、12周末隨機(jī)分批處理10只，正常組全部在12周末處理。處理大鼠空腹麻醉下腹腔靜脈取血，分離血清待用；取肝組織部分常規(guī)石蠟包埋HE染色觀察肝組織病理組織學(xué)變化，診斷參考2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組修訂的“非酒精性脂肪性肝病診療指南”[4]。部分以RIPA組織裂解液[由1%SDS、1%去氧膽酸鈉、1%NP-40、0.8%NaCl、10mmol/LEDTA-Na2、1mmol/LPMSF、10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）及0.5%混合蛋白酶抑制劑組成]進(jìn)行勻漿提取總蛋白，離心后取上清液待用；血清及肝組織TNF-α、Leptin、IL-6、ADP含量采用ELISA法檢測(cè)，肝組織勻漿總蛋白提取物定量采用BCA法檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠NASH形成中肝組織病理的動(dòng)態(tài)變化 正常組大鼠肝組織光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細(xì)胞呈多邊形。模型組大鼠肝組織4周時(shí)可見輕中度脂肪變，以肝腺泡Ⅲ區(qū)為明顯；8周時(shí)可見程度加重，呈彌漫性脂肪變，以大泡性為主，偶見小葉內(nèi)點(diǎn)狀壞死及小葉內(nèi)、匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；12周時(shí)出現(xiàn)重度脂肪變性，伴不同程度肝細(xì)胞氣球樣變，匯管區(qū)和小葉內(nèi)混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以小葉內(nèi)明顯，部分壞死灶融合成片，未見明顯肝纖維化形成。

2.2 大鼠NASH形成中血清及肝組織脂肪細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化 模型組大鼠從4周到8、12周血清和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin水平逐漸增高，而血清ADP水平則逐漸減少；在4周末，血及肝組織各項(xiàng)指標(biāo)與正常組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；8周末，除肝組織IL-6水平較正常組明顯增高外，其余各指標(biāo)與正常組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；12周末，血和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin、ADP水平與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），肝組織Leptin水平與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組12周血清TNF-α水平較4周、8周時(shí)明顯增高（P＜0.05，P＜0.01），ADP水平較4周、8周明顯降低（P＜0.01），模型組12周肝組織TNF-α水平較4周組、8周組明顯增高（P＜0.05，P＜0.01），見表1～2。

表1 各組大鼠血清脂肪細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化（±s）

表1 各組大鼠血清脂肪細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組12周比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組 4周8周12周n/只10 10 10 10 TNF-α/(ng/L) 152.69±25.49 157.00±22.2△△175.10±31.93△202.94±17.39** Leptin/(μg/L) 5.77±0.87 6.15±1.08 6.46±0.84 6.78±0.71* IL-6/(ng/L) 147.34±15.20 159.66±18.51 169.47±39.42 179.97±27.77** ADP/(μg/L) 85.99±8.13 81.16±5.64△△78.00±13.73△△65.69±6.75**

3 討論

關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制，目前占主導(dǎo)地位的為“二次打擊”學(xué)說，第一次打擊是指脂肪酸合成增多，導(dǎo)致肝細(xì)胞周圍脂質(zhì)沉積增多；第二次打擊包括脂肪酸氧化增加、氧化應(yīng)激、前炎癥因子及內(nèi)毒素血癥[5]。其中第二次打擊在NASH形成中占主導(dǎo)位置[6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在NASH的形成中起著重要作用[7-8]。脂肪細(xì)胞因子是指脂肪組織分泌產(chǎn)生的、有致炎作用或抗炎作用的蛋白產(chǎn)物，包括ADP、leptin、TNF-α、IL-6、抵抗素等。

表2 各組大鼠肝組織脂肪細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化（±s）

表2 各組大鼠肝組織脂肪細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組12周比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組 4周8周12周n/只10 10 10 10 TNF-α/(pg/mg) 2.67±0.62 2.72±0.64△△3.33±1.17△4.20±0.80** Leptin/(ng/mg) 57.40±8.76 60.36±5.09 55.07±5.06 56.26±6.66 IL-6/（pg/mg）50.14±17.19 60.94±16.10 65.25±16.34* 70.11±14.83**

ADP是來源于脂肪細(xì)胞的一種主要的抗脂肪變及抗炎癥反應(yīng)的物質(zhì)[9]，脂聯(lián)素通過與受體結(jié)合作用于靶細(xì)胞，參與脂肪代謝過程、周圍組織對(duì)胰島素的敏感性及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生等多個(gè)環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖者、胰島素抵抗者、2型糖尿病患者和NASH患者血清ADP含量均下降[10]，ADP可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α和炎癥介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)抗炎效應(yīng)[11]。Leptin具有各種免疫、代謝功能。肥胖患者具有高Leptin血癥和Leptin抵抗，高瘦素血癥可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12和IL-6等細(xì)胞因子，促進(jìn)內(nèi)臟脂肪積聚及肝星狀細(xì)胞分化，使單純性脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化[12]。TNF-α是一種具有多種生物效應(yīng)的生理炎性介質(zhì)，其可以通過損傷細(xì)胞線粒體功能，抑制脂肪酸β氧化，促進(jìn)胰島素抵抗的形成，從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。IL-6是前炎癥因子，可由脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的白細(xì)胞等分泌。升高的IL-6可降低胰島素受體的蛋白表達(dá)從而產(chǎn)生胰島素抵抗[14]；可以促進(jìn)脂肪酸分解和游離脂肪酸釋放，升高血脂和增加肝臟甘油三酯的積聚；可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，刺激肝臟表達(dá)纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白等，從而加重內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者的IL-6水平較正常人和單純脂肪肝患者明顯升高，IL-6可作為NASH治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。以上這些脂肪細(xì)胞因子的過度表達(dá)和異常缺失，形成紊亂的脂肪細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而促進(jìn)肝臟脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，最終導(dǎo)致NASH形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)間增加，大鼠肝組織呈現(xiàn)出NASH病變的漸進(jìn)性發(fā)展過程。4周時(shí)病理表現(xiàn)為單純性脂肪肝，8周時(shí)肝組織脂肪變進(jìn)一步加重，并出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；12周時(shí)，大鼠肝組織NASH形成，表現(xiàn)為重度脂肪變性，不同程度肝細(xì)胞氣球樣變，以小葉內(nèi)為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死灶等。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在NASH形成過程中，大鼠血清和肝組織的脂肪細(xì)胞因子發(fā)生發(fā)變化，表現(xiàn)為從4周到8、12周血清和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin水平逐漸增高，而血清ADP水平則逐漸減少；在4周末血及肝組織各細(xì)胞因子水平與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），至12周末血和肝組織TNF-α、IL-6水平及血清Leptin、ADP水平均較正常組明顯增高或降低（P＜0.05，P＜0.01），提示隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟脂肪細(xì)胞因子過度表達(dá)或異常缺失的程度逐漸增強(qiáng)，與肝臟脂肪變及炎癥漸進(jìn)過程一致，進(jìn)一步表明脂肪細(xì)胞因子可能參與了NASH的發(fā)生、發(fā)展；通過對(duì)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控有望能為非酒精性脂肪性肝病的防治提供新的作用靶點(diǎn)。

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TheDynamicChangeandSigni f icanceofAdipocytokinesintheDevelopmentofNonal cohol icSteatohepati?t is

CAIDanl i，CHENZhiyun，YANMaoxiang，etal.TheFi rstCl inicalMedical Col legeof Zhej iangTradi t ional Chinese Medicine University,Hangzhou(310006),China

Objective:To observe the dynamic expressions of adipocytokines in the development of nonalcoholic steatohepatitis.M ethods:Forty SD rats were random ly divided into 2 groups.The 10 rats in the control group were fed with normal diet and painlessly killed at the end of the 12th week for following detections.The 30 rats in the disease group were fed with fat-rich diet and 10 were painlessly killed at the end of the 4th,8th and 12th week,respectively.Fatty degeneration and inflammation of liver were observed with HE dyeing.The contents of serum and liver TNF-α,leptin,IL-6,and ADP were detected with ELISA.Results:Hepatic steatosis occurred in the rats from the diseases group at the end of the 4th week after fat-rich diet.At the end of the 8th,the hepatic steatosis aggravated and little inflammation occurred.At the end of the 12th,NASH occurred. The contents of serum and liver TNF-α,IL-6,and serum leptin gradually increased from the 4th to 12th week, whereas the content of serum ADP gradually decreased.At the end of the 4th week,no significant difference was noted in the contents of serum and liver TNF-α,leptin,IL-6,and ADP between the disease group and nor?mal group(P＞0.05).At the end of the 12th week,however,the contents of serum and liver TNF-α,IL-6,and se?rum Leptin of the disease group were higher than those of the control group,and ADP was lower(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusions:The disorder of the adipocytokines may play an important role in the development of NASH.

rats nonalcoholic steatohepatitis adipocytokines

2012-11-30

浙江省自然科學(xué)基金（No.Y2100170）；浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃（No.2009F80014）