張 楨 張根花 劉 琴 何徐軍 浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科 杭州310012

紫草素誘導(dǎo)自噬抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

張 楨 張根花 劉 琴 何徐軍 浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科 杭州310012

目的：探討紫草素是否通過(guò)誘導(dǎo)自噬來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。方法：采用噻唑藍(lán)比色法（MTT法）研究紫草素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3的增殖抑制作用。利用透射電鏡觀察紫草素作用胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3后的細(xì)胞內(nèi)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體結(jié)構(gòu)。利用熒光定量PCR（Real-time PCR）（熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)）和Western-blot法檢測(cè)紫草素作用后胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白Beclin-1和LC3B的表達(dá)變化。結(jié)果：紫草素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，6μg/ mL紫草素作用Bxpc-3細(xì)胞24h，其抑制率可達(dá)50%左右，且具有時(shí)間劑量依賴效應(yīng)。透射電鏡結(jié)果可見(jiàn)紫草素誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)典型的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。Real-time PCR結(jié)果顯示紫草素誘導(dǎo)后Bxpc-3細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物Beclin-1和LC3B表達(dá)增高。Western-blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)后Beclin-1表達(dá)顯著增高，LC3-Ⅰ表達(dá)變化不明顯，但是LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)明顯增高。結(jié)論：紫草素通過(guò)上調(diào)Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)來(lái)增加胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3的自噬活性，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖作用。

胰腺癌 紫草素 自噬 Beclin-1 LC3B

紫草在我國(guó)有悠久的藥用歷史，中醫(yī)臨床主要用于治療濕性斑疹、紫癜、血尿、濕疹、丹毒等。紫草素是從天然植物紫草中提純出的小分子萘醌類(lèi)化合物，近年來(lái)的大量實(shí)驗(yàn)表明紫草素及其衍生物具有抗氧化、抗炎、抗病毒以及抗腫瘤等作用[1-3]。在抗腫瘤作用方面，文獻(xiàn)報(bào)道紫草素對(duì)大腸癌、喉癌以及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用[4-6]。但是這些研究大多數(shù)集中在研究紫草素可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的，從細(xì)胞自噬角度來(lái)研究紫草素的抗腫瘤機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題在前期研究紫草素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用的基礎(chǔ)之上，利用透射電鏡、熒光定量PCR和Western-blot等技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物變化，從細(xì)胞自噬角度來(lái)研究紫草素抗胰腺癌作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；紫草素（純度98%以上）購(gòu)自

上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；高糖DMEM（Deul?becco'sModified Eagle Medium）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hy?clon公司；FBS（胎牛血清）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自杭州言科生物技術(shù)有限公司；PCR引物由華大基因公司合成；Trizol試劑盒、PrimeScriptTM RT-PCR Kit、SYBR PrimerScript Real-Time PCR kit購(gòu)自TaKaRa公司；LC3B（RabbitmAb#3868S）、Beclin-1（RabbitmAb# 3495S）和β-Tubulin（RabbitmAb#2148S）抗體購(gòu)于美國(guó)Cell signaling生物技術(shù)公司；硝酸纖維素膜、柯達(dá)膠片、ECL（超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒）試劑盒、顯影、定影試劑等常規(guī)試劑均購(gòu)自于杭州言科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL），置37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bxpc-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/L。在96孔板中每孔加入200μL上述細(xì)胞懸液。貼壁過(guò)夜后，更換新培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含紫草素藥物的培養(yǎng)液，紫草素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL，并設(shè)陰性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48及72h后，每孔加入5g/L的MTT 20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后，棄培養(yǎng)液。每孔加150μLDMSO（二甲基亞砜），避光振蕩混勻，待甲臜結(jié)晶完全溶解后，以570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)，多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200 TECAN，瑞士）測(cè)定吸光度值（A值）。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組A570－A630/對(duì)照組A570－A630）×100%。

1.2.3 電鏡觀察自噬試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bxpc-3細(xì)胞，對(duì)照組用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為6μg/mL紫草素Bxpc-3細(xì)胞處理24h后，收獲細(xì)胞，用2.5%的戊二醛固定。70%丙酮15min，80%丙酮15min，90%丙酮15min，100%丙酮10min逐級(jí)脫水。環(huán)氧樹(shù)脂、十二烷基琥珀酸酐浸透、包埋和超薄切片。切片用枸櫞酸鉛染色后，透射電鏡（JEM-1400，日本）觀察，拍照，記錄。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bxpc-3細(xì)胞，對(duì)照組用含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為6μg/ mL紫草素作用24h后，收集各組細(xì)胞。按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總mRNA，蛋白質(zhì)核酸測(cè)定儀（GeneQuant Pro DNA/RNA，美國(guó)）測(cè)定RNA質(zhì)量和濃度。按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit試劑盒的說(shuō)明操作進(jìn)行cDNA合成。利用熒光定量PCR儀（Mx3000P，美國(guó)）以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行自噬相關(guān)基因LC3B、Beclin-1的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。引物序列利用Primer Premier5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：94℃4min；94℃10s，58℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△CT法分析各個(gè)樣本中LC3B、Beclin-1相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列表

1.2.5 Western-blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bxpc-3細(xì)胞，對(duì)照組用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為6μg/ mL紫草素處理24h后，收集各組全部細(xì)胞。用RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白含量。取50μg總蛋白上樣，12%SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚炳烯酰胺凝膠）電泳。Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀24V轉(zhuǎn)膜20min。5%脫脂奶粉封閉2h。兔抗人LC3B、Beclin-1和β-Tubulin多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3次后，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2h。TBST清洗后，ECL試劑盒顯影，柯達(dá)膠片曝光。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素對(duì)Bxpc-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用 MTT結(jié)果顯示，紫草素對(duì)Bxpc-3細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。不同濃度紫草素作用Bxpc-3細(xì)胞24、48及72h后可見(jiàn)隨藥物濃度升高，Bxpc-3細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制程度逐漸升高，具有濃度、時(shí)間依賴關(guān)系（圖1）。濃度為6μg/mL的紫草素作用Bxpc-3細(xì)胞24h其抑制率可達(dá)（53.17±6.31）%。當(dāng)紫草素濃度為8μg/mL時(shí)，作用Bxpc-3細(xì)胞72h其生長(zhǎng)抑制率可達(dá)80%以上。

圖1 不同濃度紫草素對(duì)Bxpc-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.2 電鏡觀察自噬結(jié)果 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體形成是研究細(xì)胞自噬的金標(biāo)準(zhǔn)之一，與陰性對(duì)照組相比（圖2A），胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3細(xì)胞經(jīng)紫草素作用后，電鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)中充滿了自噬泡，其中含有變性的胞質(zhì)成分及其被消化降解后而形成的雙層樣典型的自噬體結(jié)構(gòu)（圖2B紅色箭頭所指）。

圖2 電鏡觀察細(xì)胞自噬結(jié)果A.陰性對(duì)照組，未經(jīng)紫草素處理的Bxpc-3細(xì)胞；B.紫草素處理后的Bxpc-3細(xì)胞，可見(jiàn)典型的雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)（紅色箭頭標(biāo)記）

2.3 自噬相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的變化 Real-time PCR

結(jié)果顯示，Bxpc-3細(xì)胞經(jīng)紫草素作用后Beclin-1基因的相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組比較明顯升高（6.02× 10-3±0.0000704 vs 1.15×10-3±0.00004，P＜0.05），而LC3B表達(dá)明顯增高（4.46×10-3±0.00025 vs2.23×10-3± 0.000352，P＜0.05）（圖3A）。進(jìn)一步用Western-blot在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證分析顯示，Beclin-1和自噬體雙層膜形成蛋白LC3B的存在形式LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ表達(dá)明顯增高（圖3B）。結(jié)果表明，紫草素的誘導(dǎo)可以上調(diào)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3的自噬活性。

3 討 論

圖3 紫草素誘導(dǎo)Bxpc-3細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化A.自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3B在紫草素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量變化（*表示P＜0.05）B.自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3B在紫草素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)蛋白表達(dá)變化

自噬是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)的蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過(guò)自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨基酸細(xì)胞和脂肪酸進(jìn)行循環(huán)利用，從而維持細(xì)胞的正常代謝和生存。同時(shí)，在某些情況下它可以選擇性地清除某些細(xì)胞成分，如受損或多余的過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、DNA，減少異常蛋白、細(xì)胞器的堆積，維持細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)[7-8]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中自噬現(xiàn)象也扮演著重要角色，自噬作用不僅具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，但是過(guò)度上調(diào)的自噬作用也可引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，亦稱Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡。目前對(duì)于自噬與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，多數(shù)認(rèn)為自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)或抑制雙重作用。一方面，自噬有促癌效應(yīng)，但過(guò)量自噬導(dǎo)致的自噬性死亡可以殺滅腫瘤細(xì)胞[9]。許多與誘導(dǎo)自噬有關(guān)的藥物已應(yīng)用于臨床，如他莫昔芬可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡[10]；苦參堿可以引起肝癌細(xì)胞形成自噬小體[11]等，這些研究表明誘導(dǎo)上調(diào)自噬活性能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞死亡。LC3和Be?clin-1均為自噬相關(guān)基因，參與了自噬體的形成，Be?clin-1是第一個(gè)確定的哺乳動(dòng)物的自噬基因，其與Class-ⅢPI3K/hvps34成復(fù)合體來(lái)控制自噬體的形成，調(diào)節(jié)其它自噬蛋白定位到前自噬體膜上，其對(duì)于自噬體的形成是必不可少[12]。LC3包括LC3A、LC3B和LC3C三個(gè)亞型，都具有LC3-I和LC3-Ⅱ兩種存在形式，但在自噬水平升高時(shí)僅LC3B在自噬體結(jié)構(gòu)中表達(dá)。LC3-Ⅱ是在自噬發(fā)生過(guò)程中，由LC3胞漿可溶的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟そY(jié)合形式而來(lái)的，LC3-Ⅱ可進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)形成，包裹待降解的細(xì)胞器等內(nèi)容物，是自噬體形成的特異性標(biāo)記蛋白，其表達(dá)與自噬結(jié)構(gòu)形成成正比。因此，選用LC3B抗體檢測(cè)LC3-I和LC3-Ⅱ的表達(dá)比值的變化，是檢測(cè)自噬最好的指標(biāo)[13]。研究表明，通過(guò)誘導(dǎo)自噬也可以顯著抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Mujumdar等[14]通過(guò)腫瘤細(xì)胞系和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)研究腫瘤細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以通過(guò)上調(diào)ATG5、Beclin-1和LC3的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提示通過(guò)誘導(dǎo)自噬也可以作為干預(yù)胰腺癌生長(zhǎng)的一種方式。文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道，紫草素可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，且作用呈劑量和時(shí)間依賴，但其作用的具體機(jī)制尚不清楚，尤其是能否通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬這方面的研究還比較少。筆者前期通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫草素能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3細(xì)胞的增殖能力，也具有時(shí)間劑量依賴效應(yīng)。為了進(jìn)一步研究其抑制增殖的可能機(jī)制，從細(xì)胞自噬的角度來(lái)研究這種現(xiàn)象。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫草素作用胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞后，可提高細(xì)胞的自噬水平，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)典型的自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)，并且使自噬體聚集于線粒體，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。利用Re?al-time PCR和Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)自噬相關(guān)基因標(biāo)志物Beclin-1和LC3B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紫草素作用后Beclin-1和LC3B（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）均顯著增高，這些結(jié)果充分證明紫草素能夠通過(guò)上調(diào)胰腺癌細(xì)胞的自噬活性，從而抑制細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫草素能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，其抗癌效應(yīng)可能與其能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)。

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Sh i kon i n-i n du c e d Au t o p hag y and Su p p r es s i ono f Pan c r ea t i c Can c e r Ce l l Pr o l i f e r a t i on

ZHANG Zhen，ZHANGGenhua，LIUQin，etal.TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou(310012),China

Objective:To investigate whether Shikonin inhibits the proliferation of pancreatic cancer cells through the autophagy pathway.Methods:After Shikonin effect,the proliferation of pancreatic cancer cell Bxpc-3 was mea?sured by the MTT method,the morphologic changes of autophagy was observed with transmission electron micro?scope.After treatment with Shikonin for 24h,the expression of autophagy related genes,such as Beclin-1 and LC3B, both in mRNA and protein level,were measured by using Real-time PCR and Western-blot methods.Results:Shi?konin significantly inhibited the proliferation of Bxpc-3 cells in a dose and time dependent manner.When Bx?pc-3 cells were treated with 6μg/ml Shikonin for 24h,the inhibition rate amounted to about 50%;the typical double membrane structure of autophagosome was found under transmission electron microscope;the expression of Beclin-1 and LC3B were up-regulated compared with negative control group.Western-blot analysis further showed that the Beclin-1 and LC3B(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio)were also significantly up-regulated after treated with Shikonin for 24h.Conclusions:Shikonin can inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells with an autopha?gy activity in pancreatic cancer cell Bxpc-3 by increasing the expression of Beclin-1 and LC3-II/LC3-I ratio.

pancreatic cancer Shikonin autophagy Beclin-1 LC3B

2012-10-29