毛惠國 蔣素文 鄭南紅 胡愛榮 丁世雄 熊 陶

浙江省寧波市第二醫(yī)院 寧波 315010

慢性乙型肝炎病毒感染者阿德福韋酯誘導(dǎo)耐藥突變與預(yù)存耐藥突變的比較分析

毛惠國 蔣素文 鄭南紅 胡愛榮 丁世雄 熊 陶

浙江省寧波市第二醫(yī)院 寧波 315010

目的：對(duì)比分析慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者阿德福韋酯（ADV）誘導(dǎo)耐藥突變與預(yù)存耐藥突變的臨床及分子生物學(xué)特點(diǎn)。方法：ADV耐藥突變的慢性HBV感染者88例，采用基因測(cè)序的方法對(duì)患者的血清標(biāo)本進(jìn)行P區(qū)耐藥基因測(cè)序，同時(shí)檢測(cè)HBV基因型、HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV-DNA。結(jié)果：88例中，發(fā)現(xiàn)ADV預(yù)存耐藥突變9例（10.23%），其中部分患者（4/9，44.44%）曾接受過不規(guī)范的抗病毒治療；誘導(dǎo)耐藥組中以rtA181T突變及單個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎?1/79，51.9%；61/ 79，77.22%）、完全突變株40例、突變株與野生株共存39例，而預(yù)存耐藥組以rtN238T突變、多位點(diǎn)突變以及突變株與野生株共存為主；誘導(dǎo)耐藥組的HBV-DNA為（5.15±1.23）log10拷貝/mL，預(yù)存耐藥組為（6.45±0.97）log10拷貝/mL（t=-3.05，P=0.003）；誘導(dǎo)耐藥組中終末期肝病患者占40.51%（32/ 79），而預(yù)存耐藥組均為終末期肝病患者（P=0.001）；兩組在性別、年齡、E抗原狀態(tài)及HBV基因型構(gòu)成方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：在未經(jīng)ADV抗病毒治療的慢性HBV感染者中可能存在ADV預(yù)存耐藥突變；誘導(dǎo)耐藥的準(zhǔn)種變異經(jīng)過篩選后變得較單一，而預(yù)存耐藥的準(zhǔn)種變異較復(fù)雜；終末期肝病患者中可能存在各種抗病毒藥物的預(yù)存耐藥突變；發(fā)生ADV誘導(dǎo)突變后的HBV-DNA復(fù)制水平常較低；患者應(yīng)該接受和執(zhí)行規(guī)范的抗病毒治療和優(yōu)化治療，以實(shí)現(xiàn)預(yù)防耐藥，避免挽救治療。

肝炎病毒 乙型 阿德福韋酯 預(yù)存耐藥突變 誘導(dǎo)耐藥突變 基因測(cè)序

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者如果病情反復(fù)活動(dòng)或者持續(xù)進(jìn)展，則需要及時(shí)給予抗病毒治療[1]，但HBV耐藥突變的產(chǎn)生無法完全避免。因而加強(qiáng)抗HBV藥物的耐藥管理，做到由耐藥后的挽救治療前進(jìn)為預(yù)防耐藥（優(yōu)選用藥及優(yōu)化治療），則顯得更加積極和主動(dòng)。目前關(guān)于阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）耐藥率的研究報(bào)道較多，而關(guān)于其預(yù)存耐藥尤其是預(yù)存耐藥與誘導(dǎo)耐藥對(duì)比分析的研究較少。本研究旨在通過對(duì)比分析慢性HBV感染者ADV誘導(dǎo)耐藥與預(yù)存耐藥的臨床特點(diǎn)及分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為指導(dǎo)規(guī)范抗病毒治療提供參考價(jià)值。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2008年6月—2010年8月我院門診和住院發(fā)生ADV耐藥突變的慢性HBV感染者88例，其中ADV預(yù)存耐藥患者9例，ADV誘導(dǎo)耐藥患者79例，所有研究對(duì)象均經(jīng)過查閱病歷和電話隨訪證實(shí)。預(yù)存耐藥是指在應(yīng)用抗病毒藥物治療之前患者體內(nèi)存在相關(guān)藥物的耐藥突變。預(yù)存耐藥患者檢測(cè)前均未接受ADV抗病毒治療，誘導(dǎo)耐藥患者均只接受ADV單藥治療。診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，終末期肝病包括肝炎肝硬化、重型肝炎（肝衰竭）和原發(fā)性肝癌。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本的收集與處理 抽取清晨空腹靜脈血4管（3mL/管），分離出血清，一管置于-70℃冰箱待作P區(qū)耐藥基因測(cè)序及HBV基因型檢測(cè)；其余分別檢測(cè)血清HBV-DNA、HBV血清學(xué)標(biāo)志物等。

1.2.2 檢測(cè)儀器及試劑 血清HBV-DNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法（ABI 7500型熒光定量PCR儀），試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供（批準(zhǔn)

文號(hào)：國藥準(zhǔn)字S20040035）；HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)采用美國雅培Abbott AxSYM System全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀；ADV耐藥基因測(cè)序及基因型分析采用美國ABI3130型基因測(cè)序儀，核酸擴(kuò)增熒光定量及測(cè)序試劑盒為上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)（國食藥監(jiān)械準(zhǔn)字2009第3400185號(hào)）。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，HBV DNA水平進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)以（±s）表示，連續(xù)性正態(tài)分布資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADV預(yù)存耐藥 88例耐藥突變者中，發(fā)現(xiàn)ADV預(yù)存耐藥突變9例（10.23%），其中4例（44.44%）有除ADV外的不規(guī)范的核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogue，NA）用藥史：2例患者曾接受拉米夫定（la?mivudine，LAM）治療，2例患者曾接受恩替卡韋（en?tecavir，ETV）治療，且均獲得病毒學(xué)應(yīng)答及生化學(xué)應(yīng)答，患者自行停藥后病情復(fù)發(fā)。4例患者均為C基因型HBV感染。在預(yù)存耐藥患者中未發(fā)現(xiàn)rtN236T位點(diǎn)變異，見表1。

2.2 ADV耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果 預(yù)存耐藥組的突變位點(diǎn)有rtL180M、rtM204V、rtA181T、rtV214A、及rtN238T突變/或共存突變，而誘導(dǎo)耐藥組的突變位點(diǎn)有rtL180M、rtM204V、rtV207M/L/I、rtS213T、rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、rtT184L及rtM250L突變/或共存突變；其他耐藥位點(diǎn)如LAM、ETV相關(guān)耐藥位點(diǎn)的突變均伴存著ADV耐藥位點(diǎn)的突變。

誘導(dǎo)耐藥組以rtA181T突變?yōu)橹鳎?1/79，51.90%），其次為rtN236T（13/79，16.46%）和rtV214A（12/79，15.19%），rtP237H和rtN238T（均為2例，2.53%）較少；而預(yù)存耐藥組以rtN238T為主（4/9，44.44%），rtA181T突變只有1例；兩組突變位點(diǎn)rtA181T及rtN238T的構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031，P=0.003）。

表1 ADV預(yù)存耐藥變異患者的基礎(chǔ)疾病、耐藥位點(diǎn)及用藥史分布

誘導(dǎo)耐藥組以單個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎?1/79，77.22%），而預(yù)存耐藥組以多個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎?/9，55.56%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049）；誘導(dǎo)耐藥組以完全突變株為主（40/79，50.63%），而預(yù)存耐藥組以完全突變株和野生株共存為主（8/9，88.89%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。

2.3 ADV耐藥突變與患者年齡、HBV-DNA的關(guān)系 誘導(dǎo)耐藥組年齡20～68歲，平均（43.2±10.0）歲，預(yù)存耐藥組24～57歲，平均（45.9±10.5）歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.76，P=0.449）；誘導(dǎo)耐藥組HBV DNA水平3.16～7.78 log10拷貝/mL，預(yù)存耐藥組5.30～8.07 log10拷貝/mL，誘導(dǎo)耐藥組低于預(yù)存耐藥組（t=-3.05，P=0.003），見表2。

表2 ADV耐藥突變與患者年齡、HBV-DNA水平的關(guān)系

2.4 兩組患者性別構(gòu)成、E抗原狀態(tài)、HBV基因型構(gòu)成及終末期肝病構(gòu)成的關(guān)系 誘導(dǎo)耐藥組中終末期肝病患者占40.51%（32/79），而預(yù)存耐藥組均為終末期肝病患者（9/9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。誘導(dǎo)耐藥組男性患者66例、女性13例，預(yù)存耐藥組均為男性患者；誘導(dǎo)耐藥組HBeAg陽性36例，陰性43例，預(yù)存耐藥組HBeAg陽性4例，陰性5例；誘導(dǎo)耐藥組C基因型HBV感染者63例，B基因型HBV感染16例，預(yù)存耐藥組C基因型HBV感染8例，B基因型HBV感染1例；兩組在性別構(gòu)成、E抗原狀態(tài)及HBV基因型構(gòu)成等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.345，1.000，1.000）。

3 討論

病毒的準(zhǔn)種（quasispecies）是受遺傳變異、競(jìng)爭(zhēng)及選擇作用影響的高度相關(guān)但不完全相同的變異株和重組基因組組成的動(dòng)態(tài)種群[2]?！堵砸倚透窝追乐沃改稀穼BV感染者體內(nèi)形成的以一個(gè)優(yōu)勢(shì)株為主的相關(guān)突變株病毒群稱為HBV準(zhǔn)種[1]。HBV高復(fù)制患者其準(zhǔn)種復(fù)雜性較高，治療前就存在各種HBV毒株，包括可能與耐藥有關(guān)的突變株。因而HBV突變可在慢性感染過程中自然發(fā)生，即在抗病毒治療之前就有預(yù)存耐藥突變的可能[3-4]，稱之為預(yù)存耐藥。

關(guān)于ADV預(yù)存耐藥的情況鮮見報(bào)道。本研究在88例ADV耐藥突變的慢性HBV感染者中，檢測(cè)出可能與ADV相關(guān)耐藥位點(diǎn)的預(yù)存耐藥突變9例（10.23%），提示在未經(jīng)ADV抗病毒治療的慢性HBV感染者中可能存在預(yù)存耐藥突變。9例預(yù)存耐藥突變的患者中4例有不規(guī)范的NA用藥史（ADV除外），均為抗病毒治療顯效但患者自行停藥后病情復(fù)發(fā)，提示某種NA停藥病情復(fù)發(fā)后可能會(huì)誘導(dǎo)另一種NA的預(yù)存耐藥。因此，無論臨床醫(yī)生還是患者，均應(yīng)該認(rèn)識(shí)到加強(qiáng)抗病毒治療依從性的重要性，避免因不規(guī)范的抗病毒治療而導(dǎo)致難治性耐藥病毒株或者多重耐藥病毒株的出現(xiàn)。

目前公認(rèn)的ADV主要耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)是rtA181V/T/S和rtN236T；近年來研究報(bào)道其他多種ADV耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)，包括rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtP237H和rtN238T/D，但對(duì)這些位點(diǎn)的突變與ADV耐藥的相關(guān)性仍存有爭(zhēng)議[5-6]。亦有報(bào)道rtI233V位點(diǎn)的變異導(dǎo)致HBV對(duì)ADV發(fā)生原發(fā)性耐藥，從而引起ADV治療失敗[7]。在本研究中，ADV的耐藥突變位點(diǎn)rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H和rtN238T均已發(fā)現(xiàn)。本組資料中突變株與野生株共存的患者較多，說明HBV準(zhǔn)種的異質(zhì)性和復(fù)雜性會(huì)明顯影響ADV的抗病毒效果：HBV病毒株的準(zhǔn)種突變?cè)綇?fù)雜，ADV就越有可能誘導(dǎo)耐藥株產(chǎn)生，從而影響臨床療效[8]。

HBV的突變率是其他DNA病毒的10倍[9]，除了HBV的自然突變，還包括HBV為了適應(yīng)各種生存壓力而產(chǎn)生多種突變：如宿主的免疫壓力或/和抗病毒藥物的壓力。ADV誘導(dǎo)耐藥組患者以單個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橹?，而預(yù)存耐藥患者以多個(gè)位點(diǎn)突變以及突變株與野生株共存為主，且預(yù)存耐藥組全部為終末期肝病患者。說明經(jīng)過ADV的抗病毒壓力篩選后，HBV的準(zhǔn)種突變較為單一和集中；而預(yù)存耐藥患者由于不規(guī)范的抗病毒治療導(dǎo)致HBV準(zhǔn)種突變較為復(fù)雜，單一位點(diǎn)的突變株不能成為優(yōu)勢(shì)株，常與野生株和其他位點(diǎn)的突變株共存；亦或者HBV感染時(shí)間越長(zhǎng)（如終末期肝病患者），由于HBV在經(jīng)歷難以計(jì)數(shù)的傳代過程中與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，其發(fā)生各種耐藥突變的幾率越大。

ADV誘導(dǎo)耐藥位點(diǎn)與可能預(yù)存耐藥位點(diǎn)的分布較為不一致：誘導(dǎo)耐藥組患者以rtA181T突變?yōu)橹?，與劉峰等[10]報(bào)道一致；雖然目前認(rèn)為rtN236T突變較A181V突變的耐藥程度更高[6]，但筆者認(rèn)為rtA181T位點(diǎn)的變異多發(fā)是否與中國患者以C基因型HBV感染有關(guān)，有待我國大樣本的進(jìn)一步研究證實(shí)；而預(yù)存耐藥組以rtN238T突變?yōu)橹?，只?例存在明確的rtA181T突變，是否存在該位點(diǎn)為ADV預(yù)存耐藥突變主要位點(diǎn)的可能？尚需在可控性良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕线M(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，以明確其表型耐藥情況。同時(shí)，在預(yù)存耐藥組患者中沒有發(fā)現(xiàn)典型的rtN236T突變，其原因可能是rtN236T的突變需要較長(zhǎng)的篩選時(shí)間，特別是需要ADV的篩選[11]。

兩組患者的HBV基因型構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與中國患者均以C基因型HBV感染為主有關(guān)[3]，且兩組在性別、年齡及E抗原狀態(tài)等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由于本組資料預(yù)存耐藥患者的例數(shù)較少，可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，有待以后的研究中擴(kuò)大樣本量深入研究。

總之，慢性HBV感染者在抗病毒治療之前就可能存在ADV或者其他NA的預(yù)存耐藥突變，且ADV誘導(dǎo)的耐藥突變位點(diǎn)復(fù)雜多樣，并常伴存其他NA的耐藥突變位點(diǎn)。盡管發(fā)生ADV耐藥突變后的HBV DNA水平有所下降，且這些位點(diǎn)的突變與ADV耐藥的相關(guān)性仍存有爭(zhēng)議，但上述情況的出現(xiàn)有可能導(dǎo)致顯著的生化學(xué)反跳及肝功能失代償。因此，在抗病毒治療之前盡可能進(jìn)行預(yù)存耐藥突變的檢測(cè)（特別是終末期肝病患者），并根據(jù)患者的臨床特征進(jìn)行合理的個(gè)體化用藥，以避免藥物選擇不當(dāng)而造成后續(xù)的挽救治療，做到由耐藥后的挽救治療前進(jìn)為預(yù)防耐藥，則顯得更加積極和主動(dòng)；同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)抗HBV藥物的耐藥管理，加強(qiáng)用藥的依從性，避免短期停藥。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.中華肝臟病雜志，2011，19（1）:13-24.

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Com parative Analysis on Induced Resistance M utations and Pre-existing Resistance M utations Related to Ad e f o v i r Di p i v o x i l i n Pa t i e n t s w i t h Ch r o n i c He p a t i t i s BVi r u s I n f e c t i o n

MAOHuiguo，JIANGSuwen，ZHENGNanhong，etal.NingboNo.2Hospital,Ningbo(315010),China

Objective:To explore the molecular epidemiological and clinical characteristics of induced resistance mutations and pre-existing resistance mutations related to adefovir dipivoxil(ADV)in patients with chronic hepati?tis B virus(HBV)infection.M ethods:The data of 88 chronic HBV-infected patients with resistance mutations related to ADV from June 2008 to August 2010 were retrospectively analyzed.The gene resistance mutations of HBV P region were analyzed by gene sequencing,and the HBV genotypes,HBV serum markers,and HBV DNA levels were also analyzed.Results:There were 9 patients with pre-existing resistance mutations in 88 patients (10.23%)and 4 out of 9(44.44%)had ill-formed usage of antiviral drugs except ADV.Patients in induced muta?tion group mostly had rtA181T mutation and single mutated site(41/79,51.9%;61/79,77.22%);40 patients had com?plete mutation and 39 had mutation co-existence with wild strain.Patients with pre-existing mutations mostly had rtN238T mutation at multiple sites(5/9,55.56%)and co-existence mutations(8/9,88.89%).The levels of HBV DNA were 5.15±1.23 log10 copies/ml in the induced mutation group and 6.45±0.97 log10 copies/ml in the pre-existing mutation group(t=-3.05,P=0.003).There were 32 patients(32/79,40.51%)with end-stage liver dis?eases in the induced mutation group compared with all patients(9/9,100%)in the pre-existing mutation group(P=0.001).No statistically significant differences was noted in constituent ratio of age,sex,HBeAg and HBV genotypes between the 2 groups(P＞0.05).Conclusion:There may be some patients with pre-existing resistance mutations related to ADV in ADV treatment-naive patients.The HBV quasispecy mutations became unified after selection of ADV,whereas they were complex in the pre-existing mutation group.The pre-existing mutations related to nu?cleos(t)ide analogues maybe exist in patients with end-stage liver diseases.The levels of HBV DNA are always lower when patients have induced resistance mutation related to ADV.It is important for patients to accept and to execute normative usage of antiviral drugs and optimal treatment to reach the aim for preventing resistance and avoiding salvage therapy.

hepatitis B virus adefovir dipivoxil pre-existing resistance mutation induced resistance mutation gene sequencing

2012-09-17

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金（No：2008B167）；浙江省寧波市優(yōu)秀中青年衛(wèi)生技術(shù)人才資助項(xiàng)目（甬衛(wèi)發(fā)[2011]145號(hào)）；浙江省寧波市領(lǐng)軍和拔尖人才培養(yǎng)工程資助項(xiàng)目（甬人社發(fā)[2012]131號(hào)）

通迅作者：胡愛榮，E-mail:har1224@126.com