陸 意 黃閩杰 張占春 浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利腫瘤放化療科 寧波 315000沈 玲 姚航平 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·論 著·

RON蛋白在正常胚胎食管組織發(fā)育成熟過(guò)程及腫瘤組織中的表達(dá)特征

陸 意 黃閩杰 張占春 浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利腫瘤放化療科 寧波 315000沈 玲 姚航平 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的：探討原癌基因RON在正常胚胎食管組織發(fā)育成熟及腫瘤組織中的表達(dá)特征及臨床意義。方法：采用高密度組織芯片和免疫組化染色方法，檢測(cè)RON在正常胚胎食管組織、成人食管組織和食管腫瘤組織中的表達(dá)及分布，半定量方法計(jì)算RON表達(dá)水平，分析比較差異。通過(guò)免疫印跡Western-blot法和RT-PCR法檢測(cè)食管癌與正常食管組織中RON蛋白和基因的表達(dá)水平。結(jié)果：RON在正常胚胎食管與成人食管組織中的表達(dá)和分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RON在食道癌組織中呈高表達(dá)（P＜0.05），其中12.5%食管癌組織中RON呈過(guò)度表達(dá)，且主要表達(dá)在食管癌細(xì)胞膜，而正常胚胎食管組織呈極弱或低表達(dá)。結(jié)論：RON在胚胎食管組織發(fā)育和成熟過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)；RON的異常表達(dá)與食管癌的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。

食管癌 酪氨酸激酶受體RON 病理機(jī)制 組織芯片

原癌基因RON是屬于MET原癌基因家族成員之一，成熟的RON蛋白是一種跨模型蛋白受體，主要表達(dá)在上皮組織中，發(fā)揮傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的生物學(xué)效用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，RON的異常表達(dá)是導(dǎo)致胃腸道上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)致病因子[2-3]。我國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家，也是死亡率最高的國(guó)家，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中、晚期。近年來(lái)生物靶向藥物逐漸應(yīng)用于惡性腫瘤的治療[4]，關(guān)于原癌基因RON與食管癌的關(guān)系值得研究。為了深入、全面地研究RON在食管上皮組織生理、病理中的作用，明確RON的表達(dá)、分布及致病機(jī)理，本研究擬通過(guò)組織芯片、免疫組織化學(xué)方法定性檢測(cè)正常胚胎食管組織發(fā)育成熟過(guò)程及腫瘤組織中RON的表達(dá)和分布情況，采用Western blot和RT-PCR法定量分析RON在食管癌鱗狀上皮組織中的表達(dá)；探討RON與正常食管組織、腫瘤組織的關(guān)系，揭示食管癌發(fā)生的具體分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究食管癌和臨床診斷、放化療、生物靶向治療等提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

正常胚胎食管組織、成人食管組織的組織芯片購(gòu)于CYBRDI（www.cybrdi.cn，陜西）。組織芯片中包含正常胚胎組織38例，3～8月齡；正常成人組織40例，平均年齡54.7歲，均為男性；食管癌組織80例，平均年齡57.3歲，均為男性，病理類型均為鱗癌。

食管癌組織及正常食管組織新鮮標(biāo)本：食管癌組織取自2011年1月—2011年12月寧波市李惠利醫(yī)院的手術(shù)切除標(biāo)本，共20例，均為男性，年齡50～65歲，平均58.6歲，術(shù)前均未行輔助治療，經(jīng)病理證實(shí)為食管癌。正常食管組織取自正常人內(nèi)鏡活檢標(biāo)本，共15例，均為男性，年齡50～60歲，平均55.2歲。兩組性別構(gòu)成及年齡分布差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述組織均為離體后30min內(nèi)取材，立即放入液氮罐，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存直至檢測(cè)。所有組織樣本的使用均經(jīng)患者同意并獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫組織化學(xué)染色分析食管組織RON蛋白表達(dá) 組織芯片在60℃烤箱中烤2h，然后經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、3%BSA封閉后，加鼠抗人RON單克隆抗體Zt/g4[5]（1：1000 in PBS），室溫孵育2h，PBS洗片后加生物素化的二抗及SABC酶復(fù)合物（鏈霉親和素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物，武漢博士德公司產(chǎn)品），室溫反應(yīng)30min，洗片后用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片，最后用奧林帕斯CKX41型顯微鏡觀察組織染色情況并拍照。結(jié)果判斷：陽(yáng)性定位，RON蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，呈棕黃色顆粒。定性：觀察5個(gè)400×高倍視野，陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量≤5%為陰性，＞5%為陽(yáng)性。通過(guò)半定量方法[6]，計(jì)算免疫組化評(píng)分，統(tǒng)計(jì)分析比較差異。

2.2 Western-blot法檢測(cè)食管組織RON蛋白表達(dá)

準(zhǔn)確稱取新鮮食管組織并絞碎，使用組織裂解液（150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.9，0.5%TritonX-100，0.6%NP-40，andprotease inhibitors，1μg/mL leu?peptin，1ug/mL pepstatin A，and 2μg/mL aprotinin）按每10mg組織加300μL裂解液冰上裂解30min后，離心取上清液，用BCA蛋白定量試劑（Bio-Rad）檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取40μg蛋白樣本加入2×SDS上樣緩沖液煮沸5min，以10%的聚丙烯酰胺凝膠泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Bio-Rad），用封閉液（含7.5%脫脂奶粉，2%BSA，0.1%Tween-20的PBS）封閉1h后，加入RON抗體R5029[3]（1：5000）4℃過(guò)夜。用洗滌緩沖液（含0.1%Tween-20 PBS）洗膜3次，加入過(guò)氧化物酶交聯(lián)的羊抗鼠IgG（Pierce，用封閉液1:10000稀釋）室溫下作用1h，PBS洗膜后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Amersham公司）顯影，全自動(dòng)熒光化學(xué)發(fā)光成像儀成像。顯影結(jié)束后，膜用抗體洗脫液（Re-blot，美國(guó)Chemicon公司）室溫孵育20min，封閉液封閉30min后，同法用兔抗人actin抗體（美國(guó)Santa Cruz）反應(yīng)作內(nèi)參。

2.3 RT-PCR檢測(cè)食管組織RON基因表達(dá) 收集各食管癌和正常食管組織，用Trizol（美國(guó)Gibco公司）常規(guī)提取總RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀（Beckman DU640）檢測(cè)，A260與A280比值為1.75～1.80。取2μg總RNA于42℃逆轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為MBI Fermentas公司產(chǎn)品）1h后，以β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。RON引物（擴(kuò)增產(chǎn)物153bp）上游：5-ATCCACCCAGTGC?CAACCTAGTT-3，下游：5-GCAGCAGGATACCAAGG AGCGT；β-actin引物（擴(kuò)增產(chǎn)物619 bp）上游：5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3，下游：5-GTCAC?GCACGATTTCCCGCT-3。引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取10μLPCR產(chǎn)物電泳，用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（BioRad GelDoc）作條帶密度掃描。根據(jù)目的基因RON與相應(yīng)β-actin的密度比值確定基因的表達(dá)水平高低。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 RON在正常胚胎食管組織和成人食管組織的表達(dá) 食管組織中RON以中-低水平表達(dá)為主，主要以鱗狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞為主。胚胎與成人食管組織中RON的表達(dá)非常接近。RON在胚胎與成人食管組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示RON在食管甚至整個(gè)消化系統(tǒng)的胚胎發(fā)育和成熟過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)，證實(shí)RON作為原癌基因在胚胎發(fā)育中的作用，見(jiàn)表1，圖1。

表1 RON蛋白在正常胚胎食管與成人食管組織的表達(dá)（）

表1 RON蛋白在正常胚胎食管與成人食管組織的表達(dá)（）

組別n/例 陽(yáng)性分布 表達(dá)量 總分胚胎食管成人食管38 40 1.1±0.8 2.2±0.3 2.5±0.4 1.3±0.2 3.6±1.2 3.5±0.5

圖1 正常食管組織RON蛋白免疫組織化學(xué)染色（×400）A：正常胚胎食管組織； B：正常成人食管組織

3.2 RON在食管癌組織中的表達(dá)和分布 通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)食管癌組織中RON的表達(dá)。評(píng)分＞6分為過(guò)度表達(dá)，圖2顯示RON在食管腫瘤組織中典型的過(guò)度表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞的胞膜和胞漿中都可見(jiàn)到高濃度的染色，尤以細(xì)胞膜為主。80例食管癌組織的RON蛋白陽(yáng)性表達(dá)率85%，其中食道癌中RON過(guò)度表達(dá)為12.5%，相應(yīng)正常食管組織陽(yáng)性率＜8%。食管癌組織RON蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)正常食管組織的表達(dá)（P＜0.05），提示RON與食管癌之間存在密切的關(guān)系，見(jiàn)表2，圖2。

表2 RON蛋白在食管鱗癌和正常食管組織表達(dá)（±s） 例

表2 RON蛋白在食管鱗癌和正常食管組織表達(dá)（±s） 例

注：與正常組織比較，*P＜0.05

組別鱗癌組織正常組織n 80 40陰性12 37陽(yáng)性68 3陽(yáng)性表達(dá)量4.4±0.5* 3.5±0.5陽(yáng)性率/% 85.0 7.5強(qiáng)陽(yáng)性10 0強(qiáng)陽(yáng)性率/% 12.5 0

圖2 食管組織RON蛋白免疫組織化學(xué)染色（×400）A：正常食管組織標(biāo)本，RON呈弱表達(dá)。B：食管癌組織標(biāo)本，食管癌細(xì)胞胞膜上可見(jiàn)大量的明顯棕黃色顆粒，RON呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

3.3 Western-blot檢測(cè)食管癌組織與正常食管組織RON蛋白表達(dá) 第2、3、4、5列的食管癌組織樣本中可見(jiàn)兩條高密度陽(yáng)性條帶，一條是RON的前體蛋白（pro-RON），分子量為180kD，另一條是成熟RON的β鏈（RON-βchain），分子量約為160kD，與第1列陽(yáng)性對(duì)照（轉(zhuǎn)染了RON基因的3T3細(xì)胞）一樣。第6、7、8、9列的正常食管組織中RON僅呈極低表達(dá)。證明RON蛋白表達(dá)水平在食管癌中顯著高于正常組織。不同腫瘤病理類型的組織標(biāo)本中RON蛋白表達(dá)水平也存在一定差異，其中第2、3、5列是食管鱗癌，第4列是食管賁門腺癌，但由于樣本數(shù)少，無(wú)法做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將做進(jìn)一步研究，見(jiàn)圖3。

圖3 食管癌及正常食管組織RON蛋白表達(dá)

3.4 PT-PCR檢測(cè)食管癌組織與正常食管組織RON基因表達(dá) 食管癌組織RON基因表達(dá)顯著高于正常食管組織，與RON蛋白表達(dá)改變一致，見(jiàn)圖4。

圖4 食管癌及正常食管組織RON基因表達(dá)

4 討論

受體酪氨酸激酶RON在上皮性腫瘤中的作用日益被重視。研究發(fā)現(xiàn)[7]，RON在調(diào)節(jié)消化道上皮細(xì)胞的增殖、遷移中發(fā)揮重要作用。RON基因在正常消化道組織中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是穩(wěn)定的，也是保守的[6，8]。有研究[6]顯示RON在正常食管和相應(yīng)的癌癥中的表達(dá)和分布情況。本研究數(shù)據(jù)亦顯示RON在食管上皮細(xì)胞的胚胎發(fā)育成熟過(guò)程中都有所表達(dá)，該結(jié)果與動(dòng)物研究RONmRNA的表達(dá)一致[9]。RON在胚胎發(fā)育過(guò)程中是必需的，本研究進(jìn)一步證明RON作為原癌基因的生理及病理意義。如圖1所示RON在胚胎食管組織黏膜表面的鱗狀上皮細(xì)胞呈中等表達(dá)。細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)都被染色。其中管腔隱窩底部的細(xì)胞染色相對(duì)較淡。這些表達(dá)模式與在成人組織中發(fā)現(xiàn)的比較類似，表明兩者有類似的機(jī)制調(diào)節(jié)RON基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。而在食管癌組織中陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞膜，與正常胚胎、成人組織的表達(dá)模式不同。本研究還證實(shí)了先前的結(jié)果，在胃腸道上皮細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)展過(guò)程中存在RON異常表達(dá)[2-3，6，8]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，胃腸道腫瘤之間RON過(guò)度表達(dá)的比率有很大的不同。如本文圖2和表2所示食道癌中RON過(guò)度表達(dá)的比率為12.5%。RON的異常表達(dá)往往導(dǎo)致侵襲活性的增加，因此RON的表達(dá)情況可能影響腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)RON的結(jié)果顯示，食管癌細(xì)胞胞膜上見(jiàn)大量的明顯棕黃色顆粒；而在正常食管組織中，幾乎少見(jiàn)明顯棕黃色顆粒。食管癌組織RON蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)正常食管組織的表達(dá)。免疫印跡Western-blot和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示食管癌組織RON蛋白表達(dá)水平顯著高于正常食管組織。這些都表明RON在正常食管發(fā)育成熟中表達(dá)，而且與食管癌的進(jìn)展存在一定的關(guān)系，但是究竟RON的表達(dá)增高參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，還是食管癌誘導(dǎo)RON表達(dá)提高，仍待研究。①RON作為原癌基因，對(duì)人體正常生長(zhǎng)發(fā)育有不可或缺的作用，但是在某些外界因素的影響下，可以被異常激活或誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?。②RON參與炎癥反應(yīng)。研究表明，RON能抑制參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子表達(dá)。已知食管癌可能與上皮腸化生、反流性食管炎有關(guān)。當(dāng)RON表達(dá)增高時(shí)，可抑制炎癥因子發(fā)揮作用，從而抑制炎癥反應(yīng)，致使炎癥得以持續(xù)感染食管上皮細(xì)胞，最終誘發(fā)癌變。③RON作為一種細(xì)胞膜受體，在某些外因作用下，能被誘導(dǎo)或促進(jìn)RON表達(dá)增高，同時(shí)促進(jìn)相關(guān)信號(hào)途徑的傳導(dǎo)，激活下游蛋白，異?；罨承┗?。本研究還發(fā)現(xiàn)并非所有食管癌組織中RON都表達(dá)陽(yáng)性，且陽(yáng)性表達(dá)水平高低也不盡相同，這與食管癌的組織病理類型、腫瘤分期有著很大的關(guān)系，有待于進(jìn)一步研究。因此，RON與食管炎的關(guān)系、食管癌具體病理分型與RON的關(guān)系及食管癌組織中RON變異體的表達(dá)情況等等都是今后的研究方向之一。在臨床上，通過(guò)免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法檢測(cè)RON的表達(dá)可以作為食管癌診斷的手段之一。RON的生物靶向治療也將是食管癌治療的發(fā)展方向之一。

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Exp r ess i ono f RONi n t heDeve l opmen t o f Emb r yon i c Esophagus Ti ssueand Esophagea l Cance r

LUYi，HUANGMinjie，ZHANGZhanchun，etal.OncogenicRadiotherapyCenter,NingboMedicalTreatmentCenter Lihuil i Hospital,Ningbo(315000),China

Objective:To investigate the expression of receptor tyrosine kinase RON in the development and pro?gression of esophagus tissue and its clinical significance.Methods:Tissue microarraies were used to detect the expression and location of RON in esophageal normal tissue and cancer tissue by immunohistochemical staining，western-blot,and RT-PCR.Results:No significant difference in RON protein was noted between embryonic tis?sue and adult tissue(P＞0.05).The expression level of RON protein in esophageal cancer significantly exceeded normal tissue and RON mostly located in the membrane of esophagus cells,while normal esophagus tissue hardly or lowly expressed RON protein.Conclusion:RON expressed stably in the esophagus embryonic development and maturation process;meanwhile,RON is related with the onset and progression of esophageal cancer.

esophageal cancer receptor tyrosine kinase RON pathomechanism tissue microarray

2012-11-07

修回日期：2012-12-10

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009C33150）

姚航平，Tel：0571-87236580；E-mail：yaohangping@126.com