朱金釵，郭 洋，向 宇，彭 彬，李君安，唐 中，楊正偉

(1.川北醫(yī)學(xué)院形態(tài)定量研究室;2.川北醫(yī)學(xué)院細(xì)胞化學(xué)研究室;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000)

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筆者實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，成年大鼠嚴(yán)重高血糖合并高血脂5 ～6 周導(dǎo)致附睪內(nèi)精子總數(shù)減少約60%，但睪丸內(nèi)精子細(xì)胞總數(shù)的減少僅約15%［1］?？紤]到睪丸內(nèi)長(zhǎng)形精子細(xì)胞有一定程度的滯留［1］，且睪丸網(wǎng)似有增厚［2］，附睪內(nèi)精子大幅減少可能與睪丸內(nèi)精子的淤積或精子向附睪的輸送障礙有關(guān)。睪丸內(nèi)精子尚無(wú)運(yùn)動(dòng)力，其輸送主要取決于Sertoli 細(xì)胞分泌的睪丸液(精子輸送的載體)和生殖管道(包括生精小管)的收縮(精子輸送的動(dòng)力)。鑒于嚴(yán)重高糖高脂血癥勢(shì)必導(dǎo)致嚴(yán)重脫水，而脫水又可能使睪丸液分泌減少，因此本文設(shè)計(jì)了一個(gè)急性脫水模型(禁水)來(lái)初步探討脫水是否會(huì)影響精子的輸送。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)

本文采用的動(dòng)物是38 只51 ～52 天齡正常雄性Sprague-Dawley 大鼠(體重約67 ～131 g)，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，均單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物按體重排序(根據(jù)修勻法)后等距隨機(jī)［3］分成兩組:對(duì)照組(n =18)與實(shí)驗(yàn)組(n =20)。對(duì)照組既喂食(顆粒飼料)又喂水，實(shí)驗(yàn)組只喂食不喂水。實(shí)驗(yàn)4 d 后分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)抽選9 只和7 只動(dòng)物取材，5 d后從余下存活動(dòng)物(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各9 只和5只)取材(取材前對(duì)照組沒(méi)有動(dòng)物死亡，而實(shí)驗(yàn)組共有8 只動(dòng)物死亡)。

取材時(shí)先用戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，然后剖開(kāi)胸腔充分暴露心臟，用真空采血管直接從左心室采集血液(2 mL 左右)。(實(shí)驗(yàn)組有兩只動(dòng)物采血不成功，沒(méi)有血液標(biāo)本)緊接著剖開(kāi)腹腔，取出雙側(cè)睪丸和附睪。

1.2 血液檢查

采血后在3 ～4 h 之內(nèi)測(cè)量紅細(xì)胞比容(采用美國(guó)貝克曼L750 型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀)以及血清鈉、鉀濃度(采用美國(guó)貝克曼DXC800 型全自動(dòng)化分析儀)。從每個(gè)動(dòng)物的血液標(biāo)本中取樣3 次進(jìn)行每個(gè)指標(biāo)的測(cè)量，以其3 次測(cè)量值的均值作為各個(gè)動(dòng)物的結(jié)果。

1.3 切片制備

器官標(biāo)本取出后立即用Bouin 液浸潤(rùn)固定48 h，然后換入70%乙醇保存。1 周后游離一側(cè)(左側(cè)或右側(cè)，不同動(dòng)物交替確定)睪丸和附睪，并稱(chēng)重、測(cè)密度以估計(jì)器官體積［3］，接著切取組織塊。

大致沿垂直于睪丸、附睪長(zhǎng)軸的方向，分別從每個(gè)睪丸、每個(gè)附睪頭部和每個(gè)附睪尾部等距隨機(jī)切取厚約2 mm 的兩個(gè)組織塊。組織塊經(jīng)乙醇和正丁醇脫水后包埋入甲基丙烯酸樹(shù)脂(2-hydroxyethyl methacrylate，德國(guó)Leica Microsystems Nussloch GmbH產(chǎn)品)。

從每個(gè)組織塊切取1 張切片(20 μm 厚)用于研究。睪丸切片用PAS(過(guò)碘酸與Schiff 試劑)和蘇木精染色(各1 h)，附睪切片僅用蘇木精染色(1 h)。

1.4 形態(tài)定量研究

1.4.1 睪丸的形態(tài)定量研究 用體視學(xué)圖像系統(tǒng)(丹麥Visiopharm 產(chǎn)品)所配置的光學(xué)顯微鏡(日本Olympus，BX51 型)的20× 物 鏡(UPlanSApo，NA 0.75)攝取圖像，在電腦顯示屏上觀察(圖1 是用100 ×物鏡所攝圖像)。從切片左上角開(kāi)始依次向右、向下、向左、向下、向右……等距(隨機(jī))抽選測(cè)試視野(視野間距設(shè)定為600 μm)，直至測(cè)完整張切片。視野圖像上疊加有4 個(gè)(2 ×2)測(cè)點(diǎn)(其橫向與縱向間距均為437 μm)和1 個(gè)禁線框(位于視野左下角，200 μm×200 μm 大小)。先在切片上表面聚焦，然后向下移動(dòng)3 μm 聚焦，以此聚焦平面作為測(cè)量平面。每2 個(gè)視野進(jìn)行1 個(gè)視野的測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)(即間隔1 個(gè)視野進(jìn)行測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)):觀察記錄位于不同結(jié)構(gòu)(生精小管壁、生精小管腔、間質(zhì))的測(cè)點(diǎn)數(shù)。測(cè)完后根據(jù)測(cè)點(diǎn)數(shù)計(jì)算睪丸內(nèi)生精小管、生精小管腔以及間質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)，并進(jìn)一步結(jié)合睪丸體積計(jì)算睪丸內(nèi)這些結(jié)構(gòu)的總體積［3］。在每個(gè)睪丸的2張切片上，總共計(jì)數(shù)了(249 ±46)個(gè)測(cè)點(diǎn)。

在每個(gè)視野上用禁線框根據(jù)禁線法則抽選有管腔的近似圓形或橢圓形的生精小管輪廓，然后測(cè)量其直徑(短徑)［3］，并定性判斷其生精細(xì)胞是否排列疏松、是否有長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留［4－5］。生精細(xì)胞排列疏松指的是，生精小管輪廓內(nèi)至少可見(jiàn)兩個(gè)裂隙，每個(gè)裂隙至少可見(jiàn)兩個(gè)緊鄰的生精細(xì)胞與另兩個(gè)緊鄰的生精細(xì)胞之間有明顯的裂縫［4］;長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留指的是，本該出現(xiàn)在生精周期前半期且位于生精小管近腔面的長(zhǎng)形精子細(xì)胞，卻出現(xiàn)在生精周期后半期的生精小管上，或位于生精小管近基膜的位置，甚至朝向紊亂(即細(xì)胞核頭尾端的方向錯(cuò)亂)［5］，見(jiàn)圖1。在每個(gè)睪丸的兩張切片上，總共觀測(cè)了(56 ±12)個(gè)生精小管輪廓。

1.4.2 附睪的形態(tài)定量研究 如上所述用體視學(xué)圖像系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)，不過(guò)所用物鏡是100 ×油鏡(UPlanSApo，NA 1.40)，視野間距為200 ～800 μm，每個(gè)視野上僅疊加1 個(gè)測(cè)點(diǎn)。根據(jù)測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)分別估計(jì)附睪內(nèi)的附睪管、附睪管內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和間質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)及其總體積。附睪頭部?jī)?nèi)的所謂附睪管在本文里包括輸出小管，附睪管內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)由密集的精子和(或)未成熟生精細(xì)胞(主要是球形精子細(xì)胞)構(gòu)成。在每個(gè)附睪頭或尾的兩張切片上，總共計(jì)數(shù)了(78 ±44)個(gè)測(cè)點(diǎn)。

1.4.3 附睪管內(nèi)細(xì)胞數(shù)的半定量分析 用普通光學(xué)顯微鏡的40 ×物鏡觀察附睪切片，盲法(不看切片編號(hào))判斷每張切片附睪管內(nèi)的細(xì)胞數(shù)(主要是精子和球形精子細(xì)胞)。精子數(shù)分較多和較少兩個(gè)(級(jí))結(jié)果，球形精子細(xì)胞數(shù)分較多、較少和散在3個(gè)結(jié)果。“較多”、“較少”分別指大部分、小部分附睪管腔內(nèi)見(jiàn)成團(tuán)的細(xì)胞，“散在”指僅見(jiàn)少量散在或稀少的細(xì)胞(圖2)。每個(gè)附睪頭或尾(附睪管內(nèi))的細(xì)胞數(shù)，以其兩張切片中細(xì)胞數(shù)較多(如果兩張切片的結(jié)果不同)的那張切片的結(jié)果表示，或以其1張切片的結(jié)果表示(如果兩張切片的結(jié)果一樣)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 大鼠脫水相關(guān)指標(biāo)(±s)

表1 大鼠脫水相關(guān)指標(biāo)(±s)

* P≤0.05，兩組指標(biāo)相比。

對(duì)照組(n=18) 實(shí)驗(yàn)組(n=12)體重(g) 113 ±25*78 ±16血細(xì)胞比容(%) 36.1 ±2.9* 50.1 ±4.1血清鈉(mmol/L) 144 ±2* 166 ±15血清鉀(mmol/L)5.26 ±0.87 4.75 ±1.23

表2 大鼠睪丸形態(tài)定量結(jié)果( ±s)

表2 大鼠睪丸形態(tài)定量結(jié)果( ±s)

* P≤0.05，兩組指標(biāo)相比;#隨機(jī)抽選的生精小管輪廓( 有管腔，圓形或橢圓形) 中，可見(jiàn)生精細(xì)胞排列疏松或長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留的小管輪廓所占百分比。

對(duì)照組(n=18) 實(shí)驗(yàn)組(n=12)睪丸體積(mm3) 751 ±186*612 ±166生精小管平均直徑(μm) 219 ±18* 204 ±22睪丸內(nèi)生精小管的體積分?jǐn)?shù)(%) 72.4 ±2.8* 76.2 ±4.9睪丸內(nèi)生精小管的總體積(mm3) 543 ±134 464 ±120睪丸內(nèi)間質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)(%) 27.6 ±2.8* 23.8 ±4.9睪丸內(nèi)間質(zhì)的總體積(mm3) 208 ±57* 148 ±56睪丸內(nèi)生精小管管腔的體積分?jǐn)?shù)(%) 3.4 ±1.3 4.2 ±2.6睪丸內(nèi)生精小管管腔的總體積(mm3) 25 ±8 27 ±22生精細(xì)胞排列疏松的生精小管輪廓數(shù)(%)# 5.9 ±12.5* 29.4 ±27.0有長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留的生精小管輪廓數(shù)(%)# 14.2 ±11.3*53.5 ±15.5

表3 大鼠附睪內(nèi)精子和球形精子細(xì)胞的數(shù)量(半定量觀察結(jié)果)

表4 大鼠附睪形態(tài)定量結(jié)果(±s)

表4 大鼠附睪形態(tài)定量結(jié)果(±s)

* P≤0.05，兩組的附睪頭部或尾部指標(biāo)相比;#P≤0.05，對(duì)照組的附睪頭部與尾部指標(biāo)相比。

附睪頭部對(duì)照組(n=18) 實(shí)驗(yàn)組(n=12)附睪尾部對(duì)照組(n=18) 實(shí)驗(yàn)組(n=12)體積(106μm3) 90.0 ±30.0* # 53.2 ±27.3 32.2 ±11.5*23.9 ±11.6附睪管的體積分?jǐn)?shù)(%) 59.9 ±10.8 62.9 ±9.2 53.2 ±6.9 54.7 ±7.6附睪管的總體積(106μm3) 55.6 ±27.6* # 34.0 ±19.3 17.1 ±6.7* 13.5 ±8.4間質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)(%) 40.2 ±10.8 37.1 ±9.2 46.8 ±6.9 45.4 ±7.6間質(zhì)的總體積(106μm3) 34.5 ±8.6* # 19.2 ±9.6 15.1 ±5.9* 10.5 ±3.9附睪管內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的體積分?jǐn)?shù)(%) 9.2 ±10.7 14.6 ±13.5 8.3 ±12.3* 19.2 ±13.1附睪管內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的總體積(106μm3) 10.1 ±12.5# 7.9 ±7.8 3.8 ±7.0*5.3 ±5.5

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體重(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))減少了30%，血細(xì)胞比容和血清鈉水平分別增加了40%和15%，但血清鉀水平無(wú)顯著性改變(表1)。

睪丸切片的一般組織學(xué)觀察可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組(與對(duì)照組相比)主要有以下特征:生精小管壁(生精上皮)內(nèi)的生精細(xì)胞排列較疏松，有長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留;Leydig 細(xì)胞核似有皺縮，邊緣不光滑(圖1)。對(duì)照組動(dòng)物有5.9%和14.2%的生精小管輪廓分別可見(jiàn)生精細(xì)胞排列疏松、長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留，而實(shí)驗(yàn)組的這兩個(gè)結(jié)果分別高達(dá)29.4%和53.5%(表2)。定量研究表明，實(shí)驗(yàn)組睪丸的主要變化是:睪丸的體積減少19%，其中生精小管的總體積減少15%(小管直徑縮小7%)，而間質(zhì)的總體積減少29% (表2)。

附睪頭或尾的一般組織學(xué)觀察難以看出兩組間有什么不同的形態(tài)特征。半定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組附睪頭部或尾部附睪管內(nèi)的球形精子細(xì)胞較多(表3、圖2)。形態(tài)定量研究表明，實(shí)驗(yàn)組附睪頭部、尾部的體積分別減少約41%、26%，其中附睪管以及附睪管之間的間質(zhì)的總體積都減少，間質(zhì)總體積的減少幅度(44%、30%)更大(表4)。不過(guò)，附睪頭部或尾部附睪管內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)的總體積沒(méi)有減少，尾部細(xì)胞團(tuán)的總體積甚至有增加(表4)。

3 討論

從血液化驗(yàn)指標(biāo)來(lái)看，本文通過(guò)禁水成功創(chuàng)建了一個(gè)高滲性脫水［6］的動(dòng)物模型。不過(guò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們注意到，禁水期間動(dòng)物的飼料消耗量日漸減少(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，這種禁水模型不僅可造成脫水，還可能造成營(yíng)養(yǎng)不良甚至緊張、焦慮。

本文研究顯示，禁水致脫水伴有動(dòng)物體重下降，器官體積減少。就睪丸與附睪來(lái)講，體積減少更多的是間質(zhì)。

從睪丸精子發(fā)生過(guò)程的組織學(xué)觀察來(lái)看，本文所用禁水致脫水的短期模型，并未明顯影響或阻斷精子發(fā)生的各個(gè)階段。精子發(fā)生雖仍在繼續(xù)，但明顯有生精細(xì)胞排列疏松并脫落以及長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留的征象。精子發(fā)生繼續(xù)的同時(shí)，精子和脫落的未成熟生精細(xì)胞從睪丸向附睪的輸送也仍在進(jìn)行，因?yàn)樵诟讲G里我們看到了更多的球形精子細(xì)胞。睪丸網(wǎng)的形態(tài)特征也支持這個(gè)判斷［7］。這說(shuō)明，睪丸液這種細(xì)胞外液(精子和未成熟生精細(xì)胞輸送的載體)的分泌還沒(méi)有受到明顯的影響。也許這是因?yàn)楸疚乃枚唐诿撍Ｐ?，還處在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)液向細(xì)胞外液轉(zhuǎn)移的病理生理過(guò)程［6］。因此，禁水致脫水這種模型對(duì)精子發(fā)生與輸送的影響，與高糖高脂血癥可能引起的改變［1－2］是不相同的。

本文研究發(fā)現(xiàn)，禁水致脫水使大鼠睪丸內(nèi)的生精細(xì)胞排列疏松并大量脫落，這說(shuō)明脫水容易損害生精細(xì)胞與Sertoli 細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)或粘附分子，或者說(shuō)生精細(xì)胞與Sertoli 細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)或粘附分子對(duì)脫水很敏感。筆者以為，這個(gè)發(fā)現(xiàn)或推測(cè)值得進(jìn)一步研究。不過(guò)有一點(diǎn)也值得注意，那就是生精細(xì)胞如此疏松與脫落，一定程度上可能與所用動(dòng)物是青春期動(dòng)物有關(guān)。因?yàn)楸疚难芯恳舶l(fā)現(xiàn)，正常青春期大鼠附睪管內(nèi)的球形精子細(xì)胞較多見(jiàn)，甚至可見(jiàn)其成團(tuán)分布，其中相對(duì)較多且容易分辨的是球形精子細(xì)胞，而正常成年大鼠附睪管內(nèi)僅偶爾可見(jiàn)散在的未成熟生精細(xì)胞［5，8］。此外，筆者實(shí)驗(yàn)室以前就注意到，精子發(fā)生活躍的較年輕大耳白兔更易出現(xiàn)球形精子細(xì)胞脫落的征象［9］。就是說(shuō)，青春期大鼠睪丸的生精細(xì)胞本來(lái)就容易脫落，這可能使某些因素(例如禁水致脫水)更易誘導(dǎo)其大量脫落。

本文也發(fā)現(xiàn)，未成熟生精細(xì)胞提前脫落伴有長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留(釋放障礙)。這二者看似矛盾，其實(shí)可能是統(tǒng)一的，即生精細(xì)胞疏松既導(dǎo)致了生精細(xì)胞脫落，也導(dǎo)致了一定程度的長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留。生精細(xì)胞疏松可導(dǎo)致其脫落容易理解，它也可導(dǎo)致長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留是因?yàn)?，長(zhǎng)形精子細(xì)胞的釋放有賴于Sertoli 細(xì)胞的功能，而生精細(xì)胞排列疏松勢(shì)必伴有Sertoli 細(xì)胞與長(zhǎng)形精子細(xì)胞之間的連接問(wèn)題(事實(shí)上生精細(xì)胞排列疏松可能就是由于Sertoli 細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的連接問(wèn)題所致)，從而使Sertoli細(xì)胞不能幫助長(zhǎng)形精子細(xì)胞正常釋放［10］。這種情況下從生精上皮“釋放”的長(zhǎng)形精子細(xì)胞(附睪內(nèi)所見(jiàn)精子)，可能實(shí)際上是隨其他生精細(xì)胞一起提前脫落的細(xì)胞(圖2)。

本文見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組睪丸Leydig 細(xì)胞核似有皺縮，那可能是脫水所致。不過(guò)，鑒于細(xì)胞形態(tài)改變小，細(xì)胞數(shù)量也看不出有什么變化，它可能不會(huì)影響睪酮分泌，即不會(huì)降低睪酮水平(尤其是睪丸內(nèi)睪酮水平)。進(jìn)一步講，睪酮水平的短期、小幅變化也難以影響睪丸的精子發(fā)生。例如，大鼠睪酮不全撤退即使持續(xù)4 個(gè)月，也僅使11.5%的生精小管輪廓出現(xiàn)生精細(xì)胞排列疏松［11－12］，睪酮急劇或幾乎完全缺乏(Leydig 細(xì)胞幾乎完全破壞所致)7 d 也僅使4.6%的生精小管輪廓出現(xiàn)生精細(xì)胞排列疏松［5］。因此我們認(rèn)為，本文所見(jiàn)禁水致脫水所致睪丸改變可能與睪酮無(wú)關(guān);即使有關(guān)，關(guān)系想必也不大。

本文采用附睪管內(nèi)的精子(和未成熟生精細(xì)胞)貯存尚少的青春期大鼠，是為了更敏感的顯示實(shí)驗(yàn)因素對(duì)附睪管內(nèi)細(xì)胞貯存量的可能影響。因?yàn)槿绻捎酶讲G內(nèi)已有大量精子貯存的成年動(dòng)物［5，8］，短短幾天(與精子發(fā)生周期相比)的實(shí)驗(yàn)因素對(duì)附睪精子貯存量的影響，即使有的話也相對(duì)較小。

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