南艷微，鄭曉玲（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，杭州 310006）

海藻酸鈉是存在于褐藻的天然高分子，殼聚糖是從貝殼類、昆蟲、細(xì)菌細(xì)胞壁及蘑菇提取的甲殼質(zhì)（幾丁質(zhì)）去乙酰化后得到的產(chǎn)物，自然界儲量豐富，因其價格低廉，且具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性和資源可持續(xù)性等優(yōu)點，越來越受到研究者的青睞[1-2]。海藻酸鈉是荷負(fù)電的天然多糖，殼聚糖是荷正電的天然多糖，海藻酸鈉分子鏈上大量的羧基與殼聚糖分子鏈上大量的伯氨基通過聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)形成具有一定機械強度、彈性和通透性能的聚電解質(zhì)復(fù)合水凝膠膜，并作為藥物控釋載體[3-4]、酶固定化載體[5]等廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材制備的單層聚電解質(zhì)膜微球已有大量文獻(xiàn)[6-7]報道，但多層聚電解質(zhì)膜微球少有報道。為此，本文以牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材，采用乳化-交聯(lián)法包裹海藻酸鈉微球制備BSA-海藻酸-殼聚糖微球（BSA-ACM）、BSA-海藻酸-殼聚糖-海藻酸鈉微球（BSA-ACAM）、BSA-海藻酸-殼聚糖-海藻酸-殼聚糖-海藻酸鈉微球（BSA-ACACAM），并對其包封率、載藥量及其體外釋放特性進(jìn)行研究。

1 材料

FJ-200高速分散均質(zhì)機（上海標(biāo)本模型廠）；高速離心機（德國Heraeus公司）、LGJO 5-Ⅱ型冷凍干燥機（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠）；ELx 800酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek Instruments.INC公司）。

海藻酸鈉[南京化學(xué)試劑有限公司，批號:10111021160，黏度:≥0.02 Pa·s（1%溶液，25℃）]；殼聚糖（玉環(huán)海洋生化有限公司，批號:D03012202，分子質(zhì)量:80000，去乙酰度:85%）；牛血清白蛋白（BSA，華美生物工程公司，批號:0108）；BCA試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；吐溫、司盤、異辛烷、異丙醇等化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 BSA-ACM的制備

精密稱取BSA，溶于1%海藻酸鈉溶液20 ml作為水相，以5%司盤-異辛烷40 ml為油相，兩相高速乳勻3 min后，滴加適量第二乳化劑30%吐溫80，再乳勻3 min，逐滴加入8%氯化鈣溶液適量后乳勻3 min，加入異丙醇后在相同轉(zhuǎn)速下最后乳勻3 min。離心后收集微球，用1%的殼聚糖溶液代替水溶液加入離心后所得微球中，孵育30 min，離心收集微球后再用同樣的殼聚糖溶液清洗1次，用水清洗2次后冷凍干燥，即得。

2.2 BSA-ACAM的制備

在乳化制得BSA-ACM后，用0.25%海藻酸鈉溶液代替水溶液加入離心后所得的微球中，孵育30 min，離心收集微球后用水清洗2次，冷凍干燥，即得。

2.3 BSA-ACACAM的制備

離心后收集的BSA-ACAM，用1%的殼聚糖孵育30 min，離心收集，再用0.25%海藻酸鈉溶液孵育30 min，離心收集微球后用水清洗2次，冷凍干燥，即得。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察

用顯微鏡和掃描電鏡觀察BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM的形態(tài)及表面特征。

2.5 包封率和載藥量的測定

將一定量的微球分散于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，在37℃、200 r/min下恒溫振蕩9 h，離心，移取上清液后補充介質(zhì)，反復(fù)提取3次后合并上清液，采用Micro-BCA法于570 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，BSA質(zhì)量濃度（c）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，然后計算微球包封率和載藥量[6]。包封率指微球中藥物量占總投藥量的百分比；載藥量指一定量微球中所含藥物的量占總質(zhì)量的比值。

2.6 體外釋放研究

分別精密稱定約30 mg的BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM至Eppendorf管中，各加入0.9%NaCl溶液釋放介質(zhì)3 ml，置37℃、70 r/min下振蕩器內(nèi)釋放，按一定時間間隔2000 r/min 離心 10min，取上清液 0.5ml，補充 0.5ml新鮮介質(zhì)[7]。Micro-BCA法測定BSA濃度，并按累積釋放量（Q）公式計算:

式中Qi:第i次取樣時Q；ci:第i次取樣時接收液中的藥物濃度；V:接收液體積；ci－1:第（i－1）次取樣時接收液中的藥物濃度；Vi:每次取樣體積；Q0:藥物釋放總量。以Q為縱坐標(biāo)，時間t為橫坐標(biāo)作圖，得藥物累積釋放曲線，考察24和360 h內(nèi)的體外釋藥情況，同時進(jìn)行Higuchi方程擬合。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 微球形態(tài)及粒徑

微球形態(tài)及大小分布見圖1。

圖1 3種微球的掃描電鏡圖a.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAMFig 1 SEM photograph of 3kinds of microspheresa.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAM

結(jié)果，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM均呈球形，表面光滑，不粘連，平均粒徑分別約為（3.79±1.33）、（3.52±0.96）、（3.07±1.17）μm。

3.2 包封率和載藥量的測定

3.2.1 Micro-BCA法?；貧w方程為c＝0.7147 A+0.0123（r＝0.9992，n＝3）。結(jié)果，BSA檢測質(zhì)量濃度在10～500 μg/ml之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2.2 包封率和載藥量。BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM包封率分別為（65.78±4.98）%、（63.99±4.83）%、（55.00±1.50）%，載藥量分別為（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%。

3.2.3 體外釋放試驗。體外釋放行為均符合Higuchi方程，方程擬合結(jié)果見表1。圖2和圖3分別為BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h和360 h內(nèi)的體外釋放曲線。

表1 BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM體外釋放方程擬合結(jié)果Tab 1 Results of equation fitting of BSA-ACM，BSA-ACAM，BSA-ACACAM release in vitro

結(jié)果可見，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h內(nèi)Q分別為32.15%、25.59%、16.72%，無明顯突釋現(xiàn)象。微球的體外釋放速率與聚電解質(zhì)膜的層數(shù)呈負(fù)相關(guān)，BSAACACAM前24 h體外釋放速率低，與BSA-ACM、BSA-ACAM有顯著性差異（P＜0.05），BSA-ACM與BSA-ACAM的體外釋放無顯著性差異（P＞0.05）。在隨后24～360 h內(nèi)BSA從微球中的釋放量呈緩慢增長趨勢，表明3種載藥微球緩釋效果明顯。

圖2 3種微球24h的體外釋放曲線Fig 2 24h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

圖3 3種微球360h的體外釋放曲線Fig 3 360h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

4 討論

海藻酸鈉是聚陰離子多糖，在水溶液中帶負(fù)電荷；殼聚糖是聚陽離子多糖，在酸性溶液中帶正電荷，兩者發(fā)生靜電聚合反應(yīng)形成微囊膜。這兩者都是親水性材料，具有良好的生物相容性，在藥物制劑方面的應(yīng)用日益增加。有文獻(xiàn)[8]報道，海藻酸-殼聚糖膜和海藻酸-殼聚糖-海藻酸膜對BSA向海藻酸鈉（鈣）微球中的擴散有明顯的阻礙作用，前者通透性強于后者，說明包裹不同層次的海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜對藥物的擴散有一定程度的影響，這一點在本試驗中也得到了證實。微球的通透性由交聯(lián)程度、膜厚、膜孔徑和孔分布決定[9]。海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜主要由多糖鏈的交聯(lián)構(gòu)成，3類微球的包封率無顯著性差異（P＞0.05）。但是BSA在ACACAM中前24 h內(nèi)的釋放速率要比在ACM、ACAM中低（P＜0.05﹚，提示BSA主要包裹在ACM中。文獻(xiàn)[10]提示反復(fù)包裹ACM只是增加微球膜的緊密性，使得微球表面細(xì)孔部分關(guān)閉，導(dǎo)致多層膜滲透性下降，從而延緩藥物的釋放。

BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM載藥量分別為（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%，表明隨包覆層數(shù)的增加，載藥量有所下降，可能是操作過程的反復(fù)進(jìn)行，離心、水洗及轉(zhuǎn)移損失了一定的藥物，但三者數(shù)據(jù)比較無顯著性差異（P＞0.05）。

試驗中發(fā)現(xiàn)孵育中所需海藻酸鈉的濃度十分重要。對0.15%、0.25%、1.0%海藻酸鈉溶液進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，0.15%海藻酸鈉溶液強度不夠，制備的ACACAM釋放與ACAM、ACM無顯著性差異（P＞0.05）；1.0%的海藻酸鈉溶液黏度太大，ACM在其中分散性差，聚結(jié)成團狀；0.25%為比較合適的濃度，ACM在其中分散性良好。

改變海藻酸鈉和殼聚糖的組成和成膜條件可調(diào)節(jié)膜厚、膜孔徑大小和膜孔分布，改變微球的通透性。本次試驗只對單一海藻酸鈉濃度、單一分子質(zhì)量及濃度的殼聚糖濃度制備的微球進(jìn)行了研究，對藥物在多層海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜微球中特性有一定的提示作用，但仍有很多因素值得進(jìn)一步考察研究。

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