南艷微，鄭曉玲（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，杭州 310006）

海藻酸鈉是存在于褐藻的天然高分子，殼聚糖是從貝殼類、昆蟲、細(xì)菌細(xì)胞壁及蘑菇提取的甲殼質(zhì)（幾丁質(zhì)）去乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物，自然界儲(chǔ)量豐富，因其價(jià)格低廉，且具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性和資源可持續(xù)性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到研究者的青睞[1-2]。海藻酸鈉是荷負(fù)電的天然多糖，殼聚糖是荷正電的天然多糖，海藻酸鈉分子鏈上大量的羧基與殼聚糖分子鏈上大量的伯氨基通過(guò)聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度、彈性和通透性能的聚電解質(zhì)復(fù)合水凝膠膜，并作為藥物控釋載體[3-4]、酶固定化載體[5]等廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材制備的單層聚電解質(zhì)膜微球已有大量文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道，但多層聚電解質(zhì)膜微球少有報(bào)道。為此，本文以牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材，采用乳化-交聯(lián)法包裹海藻酸鈉微球制備BSA-海藻酸-殼聚糖微球（BSA-ACM）、BSA-海藻酸-殼聚糖-海藻酸鈉微球（BSA-ACAM）、BSA-海藻酸-殼聚糖-海藻酸-殼聚糖-海藻酸鈉微球（BSA-ACACAM），并對(duì)其包封率、載藥量及其體外釋放特性進(jìn)行研究。

1 材料

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）、LGJO 5-Ⅱ型冷凍干燥機(jī)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ELx 800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek Instruments.INC公司）。

海藻酸鈉[南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):10111021160，黏度:≥0.02 Pa·s（1%溶液，25℃）]；殼聚糖（玉環(huán)海洋生化有限公司，批號(hào):D03012202，分子質(zhì)量:80000，去乙酰度:85%）；牛血清白蛋白（BSA，華美生物工程公司，批號(hào):0108）；BCA試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；吐溫、司盤、異辛烷、異丙醇等化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 BSA-ACM的制備

精密稱取BSA，溶于1%海藻酸鈉溶液20 ml作為水相，以5%司盤-異辛烷40 ml為油相，兩相高速乳勻3 min后，滴加適量第二乳化劑30%吐溫80，再乳勻3 min，逐滴加入8%氯化鈣溶液適量后乳勻3 min，加入異丙醇后在相同轉(zhuǎn)速下最后乳勻3 min。離心后收集微球，用1%的殼聚糖溶液代替水溶液加入離心后所得微球中，孵育30 min，離心收集微球后再用同樣的殼聚糖溶液清洗1次，用水清洗2次后冷凍干燥，即得。

2.2 BSA-ACAM的制備

在乳化制得BSA-ACM后，用0.25%海藻酸鈉溶液代替水溶液加入離心后所得的微球中，孵育30 min，離心收集微球后用水清洗2次，冷凍干燥，即得。

2.3 BSA-ACACAM的制備

離心后收集的BSA-ACAM，用1%的殼聚糖孵育30 min，離心收集，再用0.25%海藻酸鈉溶液孵育30 min，離心收集微球后用水清洗2次，冷凍干燥，即得。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察

用顯微鏡和掃描電鏡觀察BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM的形態(tài)及表面特征。

2.5 包封率和載藥量的測(cè)定

將一定量的微球分散于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，在37℃、200 r/min下恒溫振蕩9 h，離心，移取上清液后補(bǔ)充介質(zhì)，反復(fù)提取3次后合并上清液，采用Micro-BCA法于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，BSA質(zhì)量濃度（c）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，然后計(jì)算微球包封率和載藥量[6]。包封率指微球中藥物量占總投藥量的百分比；載藥量指一定量微球中所含藥物的量占總質(zhì)量的比值。

2.6 體外釋放研究

分別精密稱定約30 mg的BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM至Eppendorf管中，各加入0.9%NaCl溶液釋放介質(zhì)3 ml，置37℃、70 r/min下振蕩器內(nèi)釋放，按一定時(shí)間間隔2000 r/min 離心 10min，取上清液 0.5ml，補(bǔ)充 0.5ml新鮮介質(zhì)[7]。Micro-BCA法測(cè)定BSA濃度，并按累積釋放量（Q）公式計(jì)算:

式中Qi:第i次取樣時(shí)Q；ci:第i次取樣時(shí)接收液中的藥物濃度；V:接收液體積；ci－1:第（i－1）次取樣時(shí)接收液中的藥物濃度；Vi:每次取樣體積；Q0:藥物釋放總量。以Q為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)作圖，得藥物累積釋放曲線，考察24和360 h內(nèi)的體外釋藥情況，同時(shí)進(jìn)行Higuchi方程擬合。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 微球形態(tài)及粒徑

微球形態(tài)及大小分布見(jiàn)圖1。

圖1 3種微球的掃描電鏡圖a.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAMFig 1 SEM photograph of 3kinds of microspheresa.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAM

結(jié)果，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM均呈球形，表面光滑，不粘連，平均粒徑分別約為（3.79±1.33）、（3.52±0.96）、（3.07±1.17）μm。

3.2 包封率和載藥量的測(cè)定

3.2.1 Micro-BCA法。回歸方程為c＝0.7147 A+0.0123（r＝0.9992，n＝3）。結(jié)果，BSA檢測(cè)質(zhì)量濃度在10～500 μg/ml之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2.2 包封率和載藥量。BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM包封率分別為（65.78±4.98）%、（63.99±4.83）%、（55.00±1.50）%，載藥量分別為（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%。

3.2.3 體外釋放試驗(yàn)。體外釋放行為均符合Higuchi方程，方程擬合結(jié)果見(jiàn)表1。圖2和圖3分別為BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h和360 h內(nèi)的體外釋放曲線。

表1 BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM體外釋放方程擬合結(jié)果Tab 1 Results of equation fitting of BSA-ACM，BSA-ACAM，BSA-ACACAM release in vitro

結(jié)果可見(jiàn)，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h內(nèi)Q分別為32.15%、25.59%、16.72%，無(wú)明顯突釋現(xiàn)象。微球的體外釋放速率與聚電解質(zhì)膜的層數(shù)呈負(fù)相關(guān)，BSAACACAM前24 h體外釋放速率低，與BSA-ACM、BSA-ACAM有顯著性差異（P＜0.05），BSA-ACM與BSA-ACAM的體外釋放無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在隨后24～360 h內(nèi)BSA從微球中的釋放量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明3種載藥微球緩釋效果明顯。

圖2 3種微球24h的體外釋放曲線Fig 2 24h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

圖3 3種微球360h的體外釋放曲線Fig 3 360h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

4 討論

海藻酸鈉是聚陰離子多糖，在水溶液中帶負(fù)電荷；殼聚糖是聚陽(yáng)離子多糖，在酸性溶液中帶正電荷，兩者發(fā)生靜電聚合反應(yīng)形成微囊膜。這兩者都是親水性材料，具有良好的生物相容性，在藥物制劑方面的應(yīng)用日益增加。有文獻(xiàn)[8]報(bào)道，海藻酸-殼聚糖膜和海藻酸-殼聚糖-海藻酸膜對(duì)BSA向海藻酸鈉（鈣）微球中的擴(kuò)散有明顯的阻礙作用，前者通透性強(qiáng)于后者，說(shuō)明包裹不同層次的海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜對(duì)藥物的擴(kuò)散有一定程度的影響，這一點(diǎn)在本試驗(yàn)中也得到了證實(shí)。微球的通透性由交聯(lián)程度、膜厚、膜孔徑和孔分布決定[9]。海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜主要由多糖鏈的交聯(lián)構(gòu)成，3類微球的包封率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但是BSA在ACACAM中前24 h內(nèi)的釋放速率要比在ACM、ACAM中低（P＜0.05﹚，提示BSA主要包裹在ACM中。文獻(xiàn)[10]提示反復(fù)包裹ACM只是增加微球膜的緊密性，使得微球表面細(xì)孔部分關(guān)閉，導(dǎo)致多層膜滲透性下降，從而延緩藥物的釋放。

BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM載藥量分別為（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%，表明隨包覆層數(shù)的增加，載藥量有所下降，可能是操作過(guò)程的反復(fù)進(jìn)行，離心、水洗及轉(zhuǎn)移損失了一定的藥物，但三者數(shù)據(jù)比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孵育中所需海藻酸鈉的濃度十分重要。對(duì)0.15%、0.25%、1.0%海藻酸鈉溶液進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，0.15%海藻酸鈉溶液強(qiáng)度不夠，制備的ACACAM釋放與ACAM、ACM無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；1.0%的海藻酸鈉溶液黏度太大，ACM在其中分散性差，聚結(jié)成團(tuán)狀；0.25%為比較合適的濃度，ACM在其中分散性良好。

改變海藻酸鈉和殼聚糖的組成和成膜條件可調(diào)節(jié)膜厚、膜孔徑大小和膜孔分布，改變微球的通透性。本次試驗(yàn)只對(duì)單一海藻酸鈉濃度、單一分子質(zhì)量及濃度的殼聚糖濃度制備的微球進(jìn)行了研究，對(duì)藥物在多層海藻酸-殼聚糖聚電解質(zhì)膜微球中特性有一定的提示作用，但仍有很多因素值得進(jìn)一步考察研究。

[1]Raveendran S，Poulose AC，Yoshida Y，et al.Bacterial exopolysaccharide based nanoparticles for sustained drug delivery，cancer chemotherapy and bioimaging[J].Carbohydr Polym，2013，91（1）:22.

[2]Nagarwal RC，Kumar R，Pandit JK.Chitosan coated sodium alginate-chitosan nanoparticles loaded with 5-FU for ocular delivery:in vitro characterization and in vivo study in rabbit eye[J].Eur J Pharm Sci，2012，47（4）:678.

[3]向艷，楊紅.殼聚糖在藥物緩釋載體中的應(yīng)用[J].中國(guó)生化藥物雜志，2005，26（1）:62.

[4]王昌紅，孫曉飛.殼聚糖及其衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2007，5（3）:258.

[5]Taqieddin E，Amiji M.Enzyme immobilization in novel alginate-chitosan core-shell microcapsules[J].Biomaterials，2004，25（10）:1937.

[6]鄭彩虹，梁文權(quán)，虞和永.海藻酸-殼聚糖-聚乳酸羥乙醇酸復(fù)合微球的制備及其對(duì)蛋白釋放的調(diào)節(jié)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（2）:182.

[7]Zheng CH，Liang WQ，Yu HY，et al.Evaluation of different methods to determine the loading of proteins in PLGAmicrospheres[J].Pharmazie，2004，59（3）:232.

[8]劉映薇，于煒婷，劉袖洞，等.海藻酸-殼聚糖-海藻酸鈉（ACA）微膠囊的蛋白質(zhì)通透性研究[J].中國(guó)微生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25（3）:370.

[9]胡振華，袁偉恩，吳飛，等.氫氧化鎂對(duì)利培酮微球釋放速率的調(diào)整[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（11）:1374.

[10]李華，史國(guó)齊，萬(wàn)昌秀.殼聚糖/海藻酸鈉自組裝微球的制備及釋藥性能[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（3）:249.