董樹清，王利濤，張 霞，趙 亮

(中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

隨著我國經(jīng)濟(jì)和社會的快速增長，人們對油脂的需求量不斷增加，由此產(chǎn)生大量的餐飲業(yè)廢棄油脂，為了防止加工或精煉過的廢棄油脂重新流入飲食行業(yè)，保護(hù)人民群眾的身體健康和生命安全，許多分析工作者都在研究如何快速有效鑒別食用油的真、偽、優(yōu)、劣［1－3］。目前，國內(nèi)鑒別油品優(yōu)劣的常規(guī)方法是進(jìn)行理化檢測:水分含量、比重、折光率、皂化值、酸值、氧化值、過氧化值、羰基值、碘值等［4－9］，但這些指標(biāo)的檢測過程耗時(shí)長，實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，不易進(jìn)行現(xiàn)場操作。而且許多地溝油經(jīng)過精煉后，上述理化指標(biāo)已經(jīng)達(dá)到合格食用油標(biāo)準(zhǔn)，因此給分析工作者提出更高的檢測不合格食用油的要求。本文研究目的就是要突破上述研究的瓶頸，尋找鑒別檢測地溝油的特異性指標(biāo)，朝精煉也無法去除的物質(zhì)或處理過程中必定產(chǎn)生的物質(zhì)等方面繼續(xù)探索摻偽檢測方法［10－13］，通過盡可能少的檢測指標(biāo)，盡可能簡單的檢驗(yàn)流程鑒別食用油的偽劣。餐飲廢油脂經(jīng)過長時(shí)間聚集，在撈取、加工、儲運(yùn)過程中會發(fā)生水解、氧化、縮合、聚合、酸度增高、色澤逐漸變深，黏度增大等一系列復(fù)雜的變化，繼而會生成一系列揮發(fā)性物質(zhì)，如小分子醇、酸、醛、酯、醚類、烷烴、苯類化合物、多環(huán)芳烴類化合物等。在不飽和碳碳鍵處發(fā)生一系列氧化、斷裂等復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)在酯鍵處也發(fā)生水解、氧化、縮合等一系列反應(yīng)，從而生成大量食用油原本不含的甲醛、乙醛等醛類物質(zhì)［14－15］。在地溝油熬制和精煉過程中，此類反應(yīng)會繼續(xù)進(jìn)行，使精煉地溝油含有更多醛類物質(zhì)。基于此，本文利用地溝油中存在特異性醛類物質(zhì)的特點(diǎn)，根據(jù)醛類化合物與2，4－二硝基苯肼(DNPH)在酸性介質(zhì)中發(fā)生具有高度特異化學(xué)反應(yīng)生成衍生物腙的特性［16－17］，應(yīng)用高效液相色譜法對地溝油中醛類物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測，實(shí)現(xiàn)對地溝油或摻假食用油的鑒別測定，進(jìn)一步確定食用油的安全質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，解決目前市場上沒有合適識別偽劣油方法的難題。

1 材料與方法

表1 標(biāo)準(zhǔn)對照品的檢測限及定量限(n=5)Table 1 The detection and quantification limits of formaldehyde，acetaldehyde，propanal，butanal，pentanal and hexanal(n=5)

1.1 材料與儀器

甲醛(≥36.0%)、乙醛(≥40.0%)、丙醛(≥99.0%)、丁醛(≥98.0%)、戊醛(≥98.0%)、己醛(≥98.0%)、2，4－二硝基苯肼 北京百靈威公司;濃硫酸，濃鹽酸，乙腈，二氯甲烷 AR;測試用的水 超純水;供試油樣試樣 魯花壓榨一級花生油、二級家慶胡麻油、江河源三級菜籽油、四級鯉魚菜籽油購自超市;粗煉地溝油 工商部門;精煉地溝油 粗油實(shí)驗(yàn)室煉制。

色譜儀(包括一臺 LC－10ATvp色譜泵，一臺2487多波長紫外檢測器)島津(香港)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

1.2.1.1 衍生液的配制 將1mL濃硫酸加入盛有0.5g 2，4－二硝基苯肼的錐形瓶中。在搖蕩下滴加1mL重蒸水，溫?zé)釙r(shí)加15mL無水乙醇混勻。

1.2.1.2 衍生反應(yīng) 粗品醛腙的合成:將溶解有1.5g甲醛和乙醛，0.5g丙醛，丁醛，戊醛和己醛的25mL乙醇溶液加入到2，4－二硝基苯肼酸性溶液中。放置直至晶體析出，抽濾，得粗品。重結(jié)晶:將粗品置于錐形瓶內(nèi)，加適量乙醇，水浴熱至沸騰，反復(fù)數(shù)次，直至全溶。再加入適量乙醇，趁熱過濾。濾液在室溫下放置，待晶體析出完全后抽濾，再于145℃下干燥3h待用。制備所得各個(gè)醛腙應(yīng)用高效液相色譜面積歸一法測定，其含量均達(dá)到95%以上。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)對照品配制 精密稱取自制的甲醛腙(95%)、乙醛腙(95%)、丙醛腙(97%)、丁醛腙(98%)、戊醛腙(98%)、己醛腙(98%)對照品10.0mg，用乙腈溶解并定容至10.0mL，作為標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備液(濃度為1.0mg/mL)。

1.2.2 供試油樣試樣收集及制備

1.2.2.1 地溝油的精煉 堿煉:取市場回收粗制地溝油500mL進(jìn)行精煉，加入200mL 1.0mol/L的NaOH，地溝油迅速變濁，攪拌后，出現(xiàn)白色凝結(jié)物。水洗:加速油和皂腳分離，加入濃度10%的 NaCl溶液100mL。靜置過夜，油皂分離完成。脫色:按質(zhì)量比例加入5%的活性白土，充分?jǐn)嚢瑁?10～120℃的溫度下靜置30min，再過濾出白土，不透明的地溝油，變得色澤金黃、清澄透亮;而無味的白土，濾出后成了黑色，酸臭撲鼻。

1.2.2.3 其它油樣的處理 食用油樣不需要處理，直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4 供試樣品制備 取精煉地溝油或食用油50mL用80mL正己烷溶解后上樣于50g處理好的硅膠柱。先用550mL正己烷與乙酸乙酯的混合溶液(10∶1，V/V)洗脫，除去疏水性物質(zhì)，然后加入500mL乙醇進(jìn)行洗脫，分別將兩部分洗脫液濃縮除去溶劑后儲備待用。取正己烷與乙酸乙酯的混合(10∶1，V/V)濃縮洗脫液1mL，加入無水乙醇1mL，再加入二氯甲烷1mL，樣品完全溶解稀釋后作為空白樣。取乙醇洗脫濃縮洗脫液1mL，加入無水乙醇1mL，再加入二氯甲烷1mL后加入過量2，4－二硝基苯肼0.5mL衍生后作為供試樣。

1.2.3 液相色譜條件 色譜條件為:色譜柱:ODS－A色譜柱(5μm，250 mm ×4.6mm ID)流動相:乙腈∶水=75∶25，醋酸調(diào)節(jié) pH3，檢測波長:356nm，流速:1.0mL/min。

1.2.4 樣品分析 在相同液相色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

在ODS－A 色譜柱(5μm，250mm ×4.6mm ID)上進(jìn)行高效液相色譜分離測定。通過對流動相、pH、檢測波長、流速、進(jìn)樣量等條件的優(yōu)化，確定最佳色譜條件是:流動相是乙腈/8%醋酸水溶液，配比60/40(V/V)，pH為 3.0，檢測波長為 356nm，流速為1.0mL/min，供試樣品溶液均進(jìn)樣20μL進(jìn)行分析。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限 分別準(zhǔn)確量取六種對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，用乙腈溶解并定容至10mL，作為5個(gè)濃度的對照品溶液，精密吸取20μL進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，樣品濃度在5.0 ×10－4～1.0 ×10－8g/L 范圍內(nèi)，其吸收值呈良好的線性關(guān)系，檢測限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)均達(dá)到滿意結(jié)果，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖1 甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛標(biāo)準(zhǔn)品與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.1 Typical HPLC chromatogram of a standard six analytes mixture solution derivatization with 2，4－dinitrophenylhydrazine under the optimum conditions

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一乙醛腙對照品溶液(濃度為0.1mg/mL)，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定，吸收峰面積分別為 328580、328147、328315、327547、327645，平均為 328047。RSD=1.87%。表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一乙醛腙供試品溶液，分別于制備 0、1、2、4、6h后測定，吸收峰面積分別為328580、328589、328562、328545、328542，平 均 為328563，RSD=0.48%。表明供試品溶液在制備后6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一乙醛腙樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算含量，結(jié)果分別為 0.0419%、0.0422%、0.0415%、0.0421%、0.0417%，平均為0.0419%，RSD=0.68%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量(0.0423%)的樣品6份，分別精密加入100μL濃度為0.1mg/mL的對照品，按樣品測定方法處理，測定，計(jì)算加樣回收率，平均加樣回收率為97.44%，RSD=0.82%。表明測定方法準(zhǔn)確、可靠。

2.3 樣品測定

按上述樣品制備方法，分別制備食用油、粗制地溝油、精煉地溝油及精煉地溝油過程每一環(huán)節(jié)考察，將上述油品的空白樣和衍生樣，用0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結(jié)果見圖2～圖6。

從圖2可以看到，用此方法對不同級別的各類食用油進(jìn)行檢測，未檢出醛類物質(zhì)，說明這些食用油是可以安全食用的。

將收集粗制的地溝油進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)粗制地溝油樣品衍生后產(chǎn)生大量的醛，甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛六個(gè)小分子醛都可以被定量檢出(如圖3)。尤其甲醛、乙醛、丙醛、丁醛含量高，然而這些小分子醛對人體的胃、腸、肝、心血管都會有損害甚至有致癌的作用，地溝油的危害顯而易見。

雖然粗制地溝油很容易被檢出，然而目前市場上的地溝油大多經(jīng)過精煉，精煉地溝油的檢測目前未見準(zhǔn)確有效的方法報(bào)道。此檢測方法就是針對精煉地溝油的檢測鑒別。因此用此方法對地溝油精煉過程進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。

由于地溝油是從腐敗酸化的漂浮油污中提煉而出，含有大量酸性物質(zhì)，要加入堿才能中和，也就是堿煉。加入堿液后地溝油迅速變濁，從深紅色變成類似奶茶的黃色，攪拌后，出現(xiàn)白色凝結(jié)物，即皂角。將粗制地溝油堿洗，除去皂角，將油樣衍生后檢測，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，此時(shí)各種待測醛的含量均有降低，但是沒有明顯改善。

進(jìn)一步處理地溝油，將堿洗過的地溝油再經(jīng)過水洗，目的是為加速油和皂角分離，靜置過夜，油皂分離完成。這時(shí)的地溝油，雖然酸臭味減輕不少，但顏色依舊暗紅、不透明。將通過此步處理的油樣衍生后測定，發(fā)現(xiàn)各種醛類物質(zhì)均有明顯降低(如圖5)，這是由于水洗后部分醛的溶解以及油皂完全分離后，大量的酸敗物質(zhì)去除后，使得醛類物質(zhì)明顯減少。但是通過該檢測方法還是可以明顯檢出待測物，說明經(jīng)過水洗后的地溝油還存在這些特異性醛類物質(zhì)。

圖2 不同食用油與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of different edible oils after derivatization with 2，4－dinitrophénylhydrazine

圖3 地溝油毛油與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of crude hogwash oils after derivatization with 2，4－dinitrophenylhydrazine

圖4 地溝油毛油第一步堿洗后與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatography of crude hogwash oils by alkaline cleaning after derivatization with 2，4－dinitrophenylhydrazine

圖5 地溝油毛油第二步水洗后與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatography of alkaline cleaning hogwash oils by washing after derivatization with 2，4－dinitrophenylhydrazine

最后，將地溝油進(jìn)行脫色處理，往暗紅色的油中加入一定量的活性白土，充分?jǐn)嚢瑁龠^濾出白土，地溝油變得色澤金黃、清澄透亮。將清亮的地溝油樣衍生后測定，結(jié)果見圖6。從圖6看到醛類物質(zhì)會被活性白土吸附掉一部分，但是除戊醛外還是可以檢出其他醛類物質(zhì)，尤其是甲、乙、丙醛含量還是較高。研究還發(fā)現(xiàn)，在脫色精煉的過程中，由于需要高溫加熱，會使得甲醛、丙醛的含量增加。這也進(jìn)一步說明，甲醛等小分子脂肪醛即使精煉也無法去除，可以作為檢測地溝油的特異性物質(zhì)。

圖6 地溝油毛油第三步脫色后與2，4－二硝基苯肼發(fā)生衍生反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatography of refined hogwash oils after derivatization with 2，4－dinitrophénylhydrazine

2.4 結(jié)果分析

從樣品前處理方法、衍生條件、溶劑選擇3個(gè)方面對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品通過過柱洗脫后，乙醇洗脫部分能夠很好的富集待測樣品中的醛類物質(zhì)，25℃下待測樣與2，4－二硝基苯肼衍生1h后能得到衍生產(chǎn)物的產(chǎn)率最高。

HPLC法測定地溝油醛的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化的色譜條件下，加入2，4－二硝基苯肼后地溝油等劣質(zhì)油中有六種醛的色譜峰產(chǎn)生，即使多步精煉也無法將其去除，而其余合格油品的特征峰不能被檢出，因此將脂肪醛作為地溝油等廢棄油脂的特異性指標(biāo)，可以有效鑒定地溝油和摻假油，測定方法簡單，準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好。

通過液相色譜實(shí)驗(yàn)的測定，進(jìn)一步說明地溝油的危害是非常大的，醛類物質(zhì)超標(biāo)嚴(yán)重。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明，在鑒別合格食用油中是否摻入地溝油的過程中，將色澤、過氧化值、電導(dǎo)率與樣品的其他各種性質(zhì)結(jié)合起來綜合判斷，雖然可以對其品質(zhì)優(yōu)劣進(jìn)行初步評價(jià)，但許多精煉的地溝油的上述指標(biāo)也達(dá)到合格食用油標(biāo)準(zhǔn)，因此將其作為地溝油的檢測指標(biāo)是不可靠的。

用液相色譜測定地溝油中特異性脂肪醛的方法，與現(xiàn)行的其它方法相比較，所用儀器簡單、操作方便、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，最主要的是可以測定經(jīng)過多步精煉的地溝油，為解決目前市場上沒有合適識別偽劣油的難題提供方法。

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