吳 濤，關(guān)廣聚，劉海英

(山東大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，山東濟(jì)南 250033)

腎缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是急性腎損傷的常見原因［1］，在腎I/R導(dǎo)致的急性腎損傷中會出現(xiàn)腎血流量減少、腎小球?yàn)V過率降低和腎小管堵塞等，這可能導(dǎo)致腎組織缺氧，從而導(dǎo)致一系列的病理改變，包括細(xì)胞因子激活、活性氮氧化物、超氧化物以及凝血系統(tǒng)激活等［2］。如果腎缺血的時間足夠長或者缺血程度足夠強(qiáng)，就會導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腎功能損傷［3］。目前在臨床上尚無理想的腎損傷的治療手段，近50年來急性腎衰竭導(dǎo)致的患者住院率和病死率亦無明顯改善［4］。因此急需尋找新的治療方法。

近來研究表明，硝基脂肪酸作為內(nèi)源性的小分子物質(zhì)可以激活某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。健康人血漿中硝基油酸(nitro-oleic acid，OA-NO2)含量大約為0.6 μmol·L－1，提示它可能在生理濃度范圍內(nèi)發(fā)揮作用［5］。最近研究報道，OA-NO2是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator receptor γ，PPARγ)的內(nèi)源性激動劑，在大劑量時對PPARα及PPARσ也有激動作用［6］。而PPAR是治療代謝性疾病和炎癥導(dǎo)致的器官損傷如I/R導(dǎo)致急性腎損傷的潛在作用靶點(diǎn)。同時OA-NO2還可以通過一氧化氮通路發(fā)揮作用［7］。但目前尚無關(guān)于OA-NO2在腎I/R動物模型中腎保護(hù)作用的研究報道。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

清潔級雄性C57小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號SCXK(京)2012-0001，12～14周齡，體質(zhì)量25～32 g。所用引物由博亞公司設(shè)計合成。內(nèi)參照GAPDH引物，上游 (5'-3'):GTCTTCACTACCATGGAGAAGG，下游(5'-3'):TCATGGATGACCTTGGCCAG;白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)引物，上游(5'-3'):AGGCTCCGAGATGAACAA;下游(5'-3'):AAGGCATTAGAAACAGTCC;細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)引物，上游(5'-3'):GGTCGAAGGTGGTTCTTCTG， 下 游 (5'-3'):CCAAGCGTCCGTCTCGT;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶胞漿亞基(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate oxidase cytoplasm subunit，p47)引 物， 上 游 (5'-3'):GTCGTGGAG-AAGAGCGAGAG，下游(5'-3'):CGCTTTGATGGTTACATACGG;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶催化亞基(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase catalytic subunit，gp91)引物，上游 (5'-3'):CCGTATTGTGGGAGACTGGA，下游 (5'-3'):CTTGAGAATGGAGGCAAAGG;Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;兔抗小鼠β肌動蛋白抗體購自美國Sigma公司;兔抗小鼠TNF-α和 IL-1β抗體，購自美國 Santa Cruz公司;TNF-α ELISA試劑盒購自美國BD生物科學(xué)公司;丙二醛測定試劑盒購自美國Cayman公司;其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。硝酸纖維素膜:美國Millipore產(chǎn)品;膠片:日本Kodak產(chǎn)品;乙醚麻醉機(jī)和動物手術(shù)操作臺:美國Precision公司產(chǎn)品;9700型PCR擴(kuò)增儀:美國ABI公司生產(chǎn);電泳儀:美國Bio-Rad產(chǎn)品;Alphalmager TM 2000凝膠圖像掃描儀:美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品;Roche Hitachi 917型全自動生化分析儀:日本日立公司生產(chǎn);自動脫水機(jī)、組織包埋機(jī)和病理切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.2 動物分組和模型制備

小鼠用乙醚麻醉后，打開腹腔，分離腎左右動脈，使用血管夾夾閉兩側(cè)動脈，夾閉30 min，去除血管夾，確認(rèn)腎再灌注后關(guān)閉腹腔，ip給予預(yù)溫37℃生理鹽水1 ml。I/R+OA-NO2和 I/R+油酸(oleic acid，OA)組在去除血管夾后分別ip給予OA-NO2和OA 500 μg·kg－1。I/R模型組在去除血管夾后ip給予乙醇0.8 ml·kg－1。假手術(shù)組只進(jìn)行開腹假手術(shù)，ip 給予乙醇0.8 ml·kg－1。每組6只小鼠。再灌注期間每6 h注射1次，共4次。再灌注24 h后處死小鼠，取血和腎組織。

1.3 血漿尿素氮和肌酐水平檢測

C57小鼠手術(shù)后24 h用乙醚麻醉，自心臟采血，加EDTA作為抗凝劑，在采集2～3 min內(nèi)1500×g離心30 min，吸取上層血漿，利用全自動生化檢測儀檢測小鼠血漿尿素氮和肌酐水平。

1.4 實(shí)時PCR檢測腎組織IL-1β，ICAM-1，p47和gp91mRNA表達(dá)

取腎組織，加1.0 ml的Trizol溶液。加氯仿和異丙醇，混勻，加75%的乙醇振蕩洗滌RNA沉淀1次，留取沉淀。提取腎組織總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。具體方法參照試劑盒說明書。cDNA取出后置－20℃保存。分別取各組cDNA，進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照，目的基因mRNA的表達(dá)用2－ΔCt相對定量法計算，ΔCt為各組基因Ct值與相應(yīng)GAPDH Ct值的差值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ELISA檢測小鼠血漿TNF-α水平

C57小鼠手術(shù)后24 h用乙醚麻醉，自心臟采血，采用ELISA試劑盒測定TNF-α。血漿中TNF-α濃度用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測定各孔的吸光度值。每樣品設(shè)2復(fù)孔。

1.6 HE染色檢測腎組織病理變化

腎組織用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行4 μm厚度切片，脫蠟水化后進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.7 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測腎組織TNF-α，IL-1β，p47和 gp91蛋白表達(dá)水平

取腎組織制備組織勻漿，離心，取2 μl上清測定蛋白質(zhì)濃度，余上清變性。按70 μg蛋白質(zhì)依次上樣。分別加入 TNF-α抗體(1∶500)和 IL-1β抗體(1∶50)，振蕩過夜后浸入二抗反應(yīng)液中，配制顯影液和定影液，在膠片上顯影。將膠片圖像掃描入圖象分析系統(tǒng)，結(jié)果以膠片中目的蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)值與內(nèi)參β肌動蛋白的IA比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 腎組織丙二醛含量檢測

取腎組織，按照硫代巴比妥酸反應(yīng)試劑盒說明書要求配置腎組織勻漿液，冰上勻漿，檢測腎組織氧化損傷產(chǎn)生的丙二醛含量，在530～540 nm波長測定吸光度，計算丙二醛濃度。每樣品設(shè)2復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OA-NO2對腎I/R導(dǎo)致的腎功能損傷的影響

如表1所示，I/R模型組小鼠血漿尿素氮和肌酐水平較假手術(shù)組明顯增高，分別增加了3.1倍和4.7倍(P＜0.01)，說明 I/R 對腎功能造成損傷。與模 型 組 相 比，給 予 OA-NO2500 μg·kg－1。(I/R+OA-NO2組)小鼠血漿尿素氮和肌酐水平明顯降低，尿素氮水平減低36%(P＜0.01)，肌酐減低44%(P＜0.01)，表明給予OA-NO2能明顯改善I/R導(dǎo)致的小鼠腎功能損傷。但是給予OA 500 μg·kg－1(I/R+OA 500 μg·kg－1組)血漿尿素氮和肌酐水平與I/R模型組持平，說明OA對I/R導(dǎo)致的腎功能損傷無改善作用。

Tab.1 Effect of nitro-oleic acid(OA-NO2)on plasma urea(BUN)and creatine(Cr)of acute kidney injury mice induced by renal ischemia/reperfusion(I/R)

2.2 OA-NO2對腎I/R導(dǎo)致的腎組織病理變化的改善作用

如圖1所示，I/R模型組小鼠腎組織病理改變明顯，腎小管上皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管管腔管型堵塞(圖 1B)。I/R+OA-NO2500 μg·kg－1組(圖1C)腎組織病理損傷較I/R模型組明顯改善，腎小管上皮細(xì)胞壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失和腎小管管腔擴(kuò)張明顯減輕，未發(fā)現(xiàn)明顯腎小管管腔管型堵塞。I/R+OA 500 μg·kg－1組(圖1D)小鼠腎組織病理變化較I/R模型組無明顯改善。上述結(jié)果表明，OA-NO2可以顯著改善腎I/R導(dǎo)致的腎組織病理變化。

Fig.1 Effect of OA-NO2on renal histopathological changes of acute kidney injury mice induced by renal I/R(HE ×200).See Tab.1 for the mouse treatment.A:sham group;B:I/R modelgroup;C:I/R +OA-NO2group;D:I/R+OA group.The arrows show renal pathological changes including renal tubular epithelial cell necrosis，cell structure collapse，tubular expansion and tube cast jam.

2.3 OA-NO2對腎I/R小鼠腎組織炎癥因子和組織黏附因子mRNA表達(dá)的抑制作用

實(shí)時PCR結(jié)果(圖2)顯示，I/R模型組 IL-1β mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，與假手術(shù)組比較增加10倍以上;給予OA-NO2500 μg·kg－1處理可以顯著抑制 IL-1β mRNA 和 ICAM-1 mRNA表達(dá)(P＜0.01);I/R+OA給予 OA-NO2500 μg·kg－1組與I/R模型組比較無顯著性差異。

Fig.2 EffectofOA-NO2onmRNA expressionof interleukin-1β(IL-1β)(A)and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)(B)in kidney tissue of acute renal injury mice induced by renal I/R determined with real-time RT-PCR.See Tab.1 for the mouse treatments.The relative expression level of target gene was expressed as 2 －ΔCt .±s，n=3.＊＊P ＜0.01，compared with sham group;##P ＜0.01，compared with I/R model group.

ELISA結(jié)果顯示(圖3)，I/R模型組小鼠血漿TNF-α濃度明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，給予OA-NO2500 μg·kg－1后 TNF-α 濃度顯著降低(P ＜0.01)，但給予 OA 500 μg·kg－1則無影響，顯示血漿TNF-α濃度改變與腎組織IL-1β mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)的變化一致。

Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示(圖4)，各種處理對小鼠腎組織TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)變化與其mRNA表達(dá)的變化一致。

Fig.3 Effect of OA-NO2on plasma tumor necrosis factor-α (TNF-α)of acute kidney injury mice induced by renal I/R determined with ELISA.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊＊P ＜0.01，compared with sham group;##P ＜0.01，compared with I/R model group.

Fig.4 Effect of OA-NO2on TNF-α and IL-1β protein expression of acute kidney injury mice induced by renal I/R determined with Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.IA:integrated absorbance.Lanes 1，2，3 and 4:sham，I/R model，I/R+OA-NO2and I/R+OA groups，respectively.B and C was the semiquantative results of A.x ± s，n=3.＊＊P ＜0.01，compared with sham group;##P ＜0.01，compared with I/R model group.

2.4 OA－NO2對腎I／R小鼠腎氧化損傷相關(guān)因子和丙二醛含量的影響

如圖5所示，I／R模型組p47和gp91mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.05，P＜0.01）。OA－NO2處理可以顯著抑制p47和gp91mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；I／R＋OA組與I／R模型組比較無明顯變化。如圖6所示，與假手術(shù)組比較，I／R模型組丙二醛含量明顯增高（P＜0.01）；I／R＋OA－NO2組較I／R模型組明顯降低（P＜0.01），接近假手術(shù)組水平；I／R＋OA組與I／R模型組比較無明顯變化。

Fig.5 Effect of OA－NO2on mRNA expression of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase cytoplasm subunit（p47）（A）and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase catalytic subunit（gp91）（B）in renal tissue of acute kidney injury mice induced by renal I／R determined with realtime PCR.See Tab.1for the mouse treatment.±s，n＝6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，compared with I／R model group.

Fig.6 Effect of OA－NO2on malondialdehyde（MDA）content in renal tissue of acute kidney injury mice induced by renal I／R.See Tab.1for the mouse treatment.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，compared with sham group；＃＃P＜0.01，compared with I／R model group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，腎I／R導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷。首先，I／R模型組小鼠血漿尿素氮和肌酐水平較假手術(shù)組明顯增高，腎組織病理變化明顯，如腎小管上皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管管腔管型堵塞等；其次，血漿和腎組織炎癥因子檢測表明，I／R模型組小鼠血漿TNF－α濃度、腎組織中IL－1β和ICAM－1mRNA及IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)明顯增多；第三，I／R模型組小鼠腎組織中p47和gp91mRNA表達(dá)及MDA含量明顯升高，表明腎I／R小鼠腎氧化損傷明顯增強(qiáng)。OA－NO2可以顯著改善I／R導(dǎo)致的腎功能和病理損傷。OA－NO2處理后，小鼠血漿尿素氮和肌酐水平較I／R模型組明顯降低，腎小管上皮細(xì)胞壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失和腎小管管腔擴(kuò)張較I／R模型組明顯改善，未發(fā)現(xiàn)明顯的腎小管管腔管型堵塞。OA－NO2可以顯著改善炎癥損傷和氧化損傷。I／R＋OA－NO2組小鼠血漿TNF－α濃度及腎組織中IL－1β，ICAM－1，p47和gp91mRNA表達(dá)、MDA濃度以及IL－1β，TNF－α蛋白表達(dá)較I／R模型組明顯降低。OA對腎I／R導(dǎo)致的急性腎損傷無明顯的治療作用。因此提示，OA在體內(nèi)硝基化具有了新的腎保護(hù)作用，這為下一步OA－NO2作用機(jī)制研究提供了參考。

在腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥是重要因素。本研究結(jié)果表明，OA－NO2有效抑制腎組織IL－1β和ICAM－1基因和蛋白表達(dá)以及血漿TNF－α濃度，這些結(jié)果與以往關(guān)于OA－NO2可以直接抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子和NF－κB的活化的報道一致［6］。提示OA－NO2在I／R模型小鼠中具有抗炎作用，該作用可能與減少炎癥因子如IL－1β和TNF－α以及減少ICAM－1基因和蛋白表達(dá)，從而抑制中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等功能有關(guān)。

炎癥反應(yīng)發(fā)生時炎癥細(xì)胞壞死和凋亡是腎損傷發(fā)生及持續(xù)的重要因素。中性粒細(xì)胞缺少會減輕短暫動脈夾閉導(dǎo)致的心臟損傷。中性粒細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)生的重要機(jī)制是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphateoxidase，NADPH），包括p22，gp91，p47，p67和p40，其中g(shù)p91和p47最為重要，因?yàn)間p91為催化亞基，而p47則作用于各亞基的移位和NADPH的活化［8］。本研究結(jié)果表明，OA－NO2可以有效抑制I／R導(dǎo)致的腎組織gp91和p47mRNA表達(dá)增加。因此，OA－NO2可能通過直接或間接抑制NADPH表達(dá)而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

OA－NO2作為內(nèi)源性的小分子物質(zhì)可以激活某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而在腎I／R損傷發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。據(jù)報道，在腎I／R損傷中PPARγ具有細(xì)胞保護(hù)作用，應(yīng)用PPAR激動劑對于腎I／R模型小鼠的腎功能具有保護(hù)作用，并改善組織病理變化；相反PPARα基因敲除的小鼠可以加重腎I／R模型 小 鼠 腎 損 傷［9－10］。盡 管 PPARα，PPARσ 和PPARγ均具有抗炎和抗氧化作用，但三者發(fā)揮作用的機(jī)制可能不同。PPARα可能通過激活脂肪酸β氧化在順鉑導(dǎo)致的腎損傷中發(fā)揮腎保護(hù)作用［11］。PPARσ可能通過激活蛋白激酶B通路增加腎小管上皮細(xì)胞的增殖保護(hù)腎功能［10］。PPARγ激動劑在I／R模 型 小 鼠 中 有 腎 保 護(hù) 作 用［12］。OA－NO2對PPARα，PPARσ和PPARγ均有激動作用［5］。因此推測，OA－NO2的腎保護(hù)作用及腎炎癥損傷修復(fù)可能包括PPAR的細(xì)胞保護(hù)作用，不過這一作用尚待進(jìn)一步研究證明。

腎I／R損傷是急性腎功能衰竭的主要因素。目前急需明確急性腎衰竭的病因和加重因素并尋找合適的干預(yù)藥物。本研究表明，OA－NO2可以減輕腎I／R模型小鼠腎損傷，可以通過減輕腎炎癥損傷和氧化損傷從而改善腎功能和腎組織病理變化。本研究結(jié)果提示，內(nèi)源性硝基脂肪酸對于急性腎損傷導(dǎo)致的腎功能和腎組織病理損傷可能具有保護(hù)作用。

［1］ Regner KR，Roman RJ.Role of medullary blood flow in the pathogenesis of renal ischemia－reperfusion injury［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2012，21（1）：33－38.

［2］ Legrand M，Mik EG，Johannes T，Payen D，Ince C.Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney［J］.Mol Med，2008，14（7－8）：502－516.

［3］ Price PM，Hodeify R.A possible mechanism of renal cell death after ischemia／reperfusion［J］.Kidney Int，2012，81（8）：720－721.

［4］ Bove T，Calabrò MG，Landoni G，Aletti G，Marino G，Crescenzi G，et al.The incidence and risk of acute renal failure after cardiac surgery［J］.J Cardiothorac Vasc Anesth，2004，18（4）：442－445.

［5］ Baker PR，Lin Y，Schopfer FJ，Woodcock SR，Groeger AL，Batthyany C，et al.Fatty acid transduction of nitric oxide signaling：multiple nitrated unsaturated fatty acid derivatives exist in human blood and urine and serve as endogenous peroxisome proliferator－activated receptor ligands［J］.J Biol Chem，2005，280（51）：42464－42475.

［6］ Cui T，Schopfer FJ，Zhang J，Chen K，Ichikawa T，Baker PR，et al.Nitrated fatty acids：endogenous anti－inflammatory signaling mediators［J］.J Biol Chem，2006，281（47）：35686－35698.

［7］ Baker LM，Baker PR，Golin－Bisello F，Schopfer FJ，F(xiàn)ink M，Woodcock SR，et al.Nitro－fatty acid reaction with glutathione and cysteine.Kinetic analysis of thiol alkylation by a Michael addition reaction［J］.J Biol Chem，2007，282（42）：31085－31093.

［8］ Nauseef WM.How human neutrophils kill and degrade microbes：an integrated view［J］.Immunol Rev，2007，219：88－102.

［9］ Cheng CF，Lian WS，Chen SH，Lai PF，Li HF，Lan YF，et al.Protective effects of adiponectin against renal ischemiareperfusion injury via prostacyclin－PPARα－h(huán)eme oxygenase－1 signaling pathway［J］.J Cell Physiol，2012，227（1）：239－249.

［10］ Letavernier E，Perez J，Joye E，Bellocq A，F(xiàn)ouqueray B，Haymann JP，et al.Peroxisome proliferator－activated receptor beta／delta exerts a strong protection from ischemic acute renal failure［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（8）：2395－2402.

［11］ Li S，Nagothu KK，Desai V，Lee T，Branham W，Moland C，et al.Transgenic expression of proximal tubule peroxisome proliferator－activated receptor－alpha in mice confers protection during acute kidney injury［J］.Kidney Int，2009，76（10）：1049－1062.

［12］ Miglio G， Rosa AC， Rattazzi L， Grange C，Collino M，Camussi G，et al.The subtypes of peroxisome proliferatoractivated receptors expressed by human podocytes and their role in decreasing podocyte injury［J］.Br J Pharmacol，2011，162（1）：111－125.