王 雁，湯納平，富 欣，殷承勝，季龍鳳，楊琛懋，黃歡夏，馬 璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203）

藥物誘導(dǎo)的肝損傷是終止藥物研發(fā)和撤市的主要原因之一［1－2］。近60年以來，評價藥物性肝損傷和區(qū)分不同類型肝損傷的指標(biāo)主要是依據(jù)對血液中酶的檢測，如廣泛使用的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（gl uta mic pyr uric trans minase，GPT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（gl utamic oxaloacetic trans minase，GOT）。但這些指標(biāo)在肝外損傷如骨骼肌損傷、腸胃損傷中也能檢測到升高［3－4］，其結(jié)果并不總是與組織病理學(xué)檢測結(jié)果一致［5］。隨著高通量分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，新的肝損傷生物標(biāo)志物被報道，比如對 氧磷酶1，血清F蛋白等［6－7］，但均因技術(shù)局限而不能被推廣。微RNA（micro RNA，mi R）分子可以在體液循環(huán)中穩(wěn)定存在［8］，從而為mi R作為非侵襲性生物標(biāo)志各種疾病的預(yù)防和診斷方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

mi R－122是較早被發(fā)現(xiàn)且研究較為詳細(xì)的一種mi R。2002年，Lagos－Quintana等［9］通過對成年小鼠各種組織細(xì)胞中多種mi R系統(tǒng)克隆和測序以及進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)mi R－122僅在肝組織細(xì)胞中表達(dá)且是肝細(xì)胞中表達(dá)量最高的mi R，進(jìn)一步研究證明，循環(huán)mi R－122在藥物誘導(dǎo)的肝損傷中要早于傳統(tǒng)指標(biāo)升高且能有效區(qū)分肝損傷與肝外損傷［10－11］，并且其定量檢測技術(shù)實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－qPCR）檢測范圍廣、重復(fù)性好和靈敏度高，但是，目前一些文獻(xiàn)報道循環(huán)mi R相對定量普遍使用的被認(rèn)為表達(dá)恒定的管家基因會隨著實驗條件、樣品類型等不同而表達(dá)不穩(wěn)定［12－13］，因此，使用適合不同實驗條件的穩(wěn)定內(nèi)參基因?qū)τ赗T－qPCR獲得準(zhǔn)確結(jié)果非常重要。

本實驗使用前期工作篩選的在大鼠急性肝損傷血漿中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源性校正基因mi R－103［14］，定量檢測了血漿mi R－122在不同程度肝損傷發(fā)生、發(fā)展過程中不同時間點的表達(dá)，評價血漿mi R－122作為早期肝損傷靈敏生物標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Hitachi 7060全自動生化分析儀（日本Hitachi集團(tuán)）；Excelsior ES組織脫水機(jī)、Histocentre 3型組織包埋機(jī)、Nano Dr op 1000分光光度儀和臺式高速低溫離心機(jī)（美國Ther mo公司）；RM2135型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)和ST5020 HE染色儀（美國Leica公司），PHY－Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；Axioscope.A1熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），實時PCR儀（美國Applied Biosystems公司），對乙酰氨基酚，購自Sigma－Aldrich中國有限公司，羧甲基纖維素鈉（CMC－Na），購自國藥集團(tuán)；焦碳酸二乙酯化學(xué)試劑；mir VanaTM小干擾mRNA（mi RNA）分離試劑盒，購自美國Ambion公司；miScript SYBR?Green PCR Kit PCR，miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自德國Qiagen公司；Trizol LS，購自美國Invitr ogen公司。

1.2 動物

雄性SD大鼠，6～7周齡，SPF級，90只，體質(zhì)量160～180 g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2008－0016。大鼠飼養(yǎng)溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，12／12 h明暗交替，SPF環(huán)境自由進(jìn)食、飲水。動物適應(yīng)1周后開始實驗，實驗前至少禁食12 h，不禁水，給藥后正常進(jìn)食和進(jìn)水。

1.3 動物分組給藥和樣本的采集

大鼠ig給予對乙酰氨基酚625和1250 mg·kg－1（n＝42），溶媒對照組（n＝6）ig給予0.5%CMC－Na 10 ml·kg－1。其中溶媒對照組大鼠在單次ig給藥后24 h解剖，對乙酰氨基酚組分別于給藥后1.5，3，6，12，24，36和96 h時每組各取6只大鼠，腹主動脈采取足夠的血清及血漿用于臨床生化指標(biāo)檢測和總RNA的提取。

1.4 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

大鼠腹主動脈采血后放血處死，解剖大鼠摘取肝，取肝左外葉和右外葉，用生理鹽水洗滌，在10%多聚甲醛中固定至少2 d，修樣，脫水，石蠟包埋，切成5μm厚的肝組織切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.5 血清GPT和GOT的檢測

參照GPT和GOT生化試劑盒說明書使用Hitachi－7060型全自動生化分析儀檢測所有大鼠血清中GPT和GOT的活性。

1.6 血漿總RNA的提取

血漿按照張毅等［11］方法，分別經(jīng)過1600×g，4℃，10 min和16 000×g，4℃，10 min離心2次后，取500μl血漿置于無RNA／DNA酶的離心管中，并加入625μl的Trizol LS，混勻，室溫靜置5 min后于－80℃低溫保存。取1.3中已加入Trizol LS的血漿，加入167μl的氯仿，混勻，置室溫10 min，12 000×g，4℃離心15 min，使水相和有機(jī)相分離。小心取上層水相液體，移至新的Ep管中。之后參照mi RNA分離試劑盒說明書中的步驟提取總RNA，用分離光度計測定RNA在260 nm處的吸光 度 （absorbance，A），以 A260nm／A280nm及 A260nm／A230nm評估提取的總RNA的濃度和質(zhì)量。只有A260nm／A280nm在1.7～2.0之間，A260nm／A230nm接近2.0的樣品才被用于進(jìn)一步的RT－qPCR定量分析。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR檢測mi R－122的表達(dá)

20μl逆轉(zhuǎn)錄體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，逆轉(zhuǎn)錄混合液1μl，DEPC水5μl，RNA模板10μl，混勻后置于37℃60 min，95℃5 min，得到的產(chǎn)物保存在－80℃條件下或立即進(jìn)行下步反應(yīng)。合成的c DNA用于實時定量PCR，20μl體系包括2×SYBR Green Mix 10μl，反向引物0.5μl（試劑盒中提供），正向引物1μl（由Invitrogen合成），焦碳酸二乙酯水7.5μl，c DNA模板1μl。反應(yīng)條件為95℃，酶活化15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)。采用前期實驗確認(rèn)的急性肝損傷穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源性基因mi R－103為校正基因，按照文獻(xiàn)方法［15］計算mi R－122相對表達(dá)量計算公式為2－ΔΔCt＝2［（Ct mi R－122－Ct mi R－103）給藥組 －（Ct mi R－122－Ct mi R－103）對照組］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對乙酰氨基酚對肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

給藥后不同時間點肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（圖1）顯示，對乙酰氨基酚625 mg·kg－1藥后12 h肝腺泡 Ⅲ帶 出現(xiàn)空泡樣變性、肝竇充血（圖1 A5），給藥后24 h肝腺泡 Ⅲ帶出現(xiàn)細(xì)胞壞死并且有大量的炎癥細(xì)胞浸潤（圖1 A6），而給藥后36 h基本恢復(fù)正常（圖1 A7）；對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1給藥后6h肝腺泡Ⅲ帶出現(xiàn)空泡樣變性、肝竇充血（圖1B4），給藥后12 h空泡樣變性細(xì)胞增多，且Ⅲ帶有明顯的細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B5），24 h后肝細(xì)胞壞死區(qū)域擴(kuò)大，肝索紊亂且大量炎癥細(xì)胞聚集（圖1B6），36 h后仍觀察到肝腺泡Ⅲ帶炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B7）。由此可知，對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1組肝損傷發(fā)生的時間早于625 mg·kg－1組，且損傷持續(xù)時間較長，肝損傷區(qū)域廣泛。

2.2 對乙酰氨基酚對GPT和GOT活性的影響

與溶媒對照組相比，對乙酰氨基酚625和1250 mg·kg－1組大鼠血清GPT從12 h開始有顯著性升高，一直持續(xù)到24 h達(dá)到最高值，36 h開始恢復(fù)正常水平，并且對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1組GPT的活性均是對照組的2倍以上（圖2 A）。如圖2B所示，對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1組大鼠血清GOT的活性6 h與對照組相比就有顯著性升高（P＜0.05），12～24 h GOT活性均高于對照組的2倍以上，對乙酰氨基酚625 mg·kg－1組大鼠血清GOT活性在對乙酰氨基酚暴露12 h有顯著性升高，并且對乙酰氨基酚給藥組大鼠血清GOT的活性在給藥后96 h較對照組仍有顯著性升高（P＜0.05）。

2.3 對乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷大鼠血漿中mi R－122的動力學(xué)變化

由圖3可見，與溶媒對照組相比，對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1組大鼠血漿 mi R－122 1.5 h升高3.6倍，12 h升高200倍左右達(dá)到峰值，36 h仍然是對照組的8.8倍，36 h幾乎恢復(fù)正常水平。對乙酰氨基酚625 mg·kg－1組血漿 mi R－122 6 h開始升高，12 h升高67倍左右達(dá)到峰值，36 h幾乎恢復(fù)正常水平。由圖3看出，血漿mi R－122在對乙酰氨基酚給藥的含量變化呈現(xiàn)出劑量依賴性，且對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1給藥后1.5～12 h的變化呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性（r＝0.952，P＝0.048）。

Fig.1 Liver histopathology of rats given acetaminophen（APAP）（HE×200）.Rats were ig given APAP 0（nor mal control），625 and 1250 mg·kg－1，the liver samples were collected at 0，1.5，3，6，12，24，36 and 96 h after ad ministration.A1－A8：APAP 625 mg·kg－1 group at 0，1.5，3，6，12，24，36 and 96 h after ad ministration.B1－B8：APAP 1250 mg·kg－1 group at 0，1.5，3，6，12，24，36 and 96 h after ad ministration.Black arr ows：vacuolated hepatocytes；yellow arr ows：congestion in sinusoids；green arr ows：infla mmatory cells；N：centrilobular necr osis.

Fig.2 Changes in serum glutamic pyruric transminase（GPT）（A）and glutamic oxaloacetic tr nasminase（GOT）activities（B）of rats with acute liver injury induced by APAP.±s，n＝6.＊P＜0.05，compared with 0 h（control）.

Fig.3 Changes in mi R－122 expression in plasma of rats with actue liver injury induced by APAP.Endogenous mi R－103 was used as the nor malizer［14］.±s，n＝6.

3 討論

mi R是主要參與細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等重要的生理病理過程［16－17］，可廣泛存在于血液、尿液和腦脊液等各種生物體液中［18］，而循環(huán)mi R據(jù)報道有望成為癌癥、心血管疾病、自身免疫疾病等的診斷指標(biāo)。研究循環(huán)mi R在組織損傷中的表達(dá)變化，有助于從分子水平了解藥物性肝損傷的機(jī)制。

mi R－122是一個調(diào)節(jié)肝發(fā)育的“肝特異性mi R”［19］。研究表明，在生理狀態(tài)下，mi R－122參與肝細(xì)胞發(fā)育、分化代謝，以及肝細(xì)胞應(yīng)急應(yīng)答等。應(yīng)用反義寡聚核苷酸抑制肝mi R－122的表達(dá)，肝功能受損，膽固醇合成下降，說明mi R－122對維持肝正常功能起著重要作用［20］。綜合mi R－122上述特性，使它成為了檢測肝損傷潛在的理想生物標(biāo)志物。

血漿中mi R－122的檢測主要使用RT－q PCR技術(shù)，但是很多因素都將會影響mi R的最終定量結(jié)果［12］。因此，選擇一個合適穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)τ讷@得精確的RT－q PCR結(jié)果非常重要。因為循環(huán)mi R－122定量常用的內(nèi)參基因在血液中的穩(wěn)定性不同于mi R［21］，因此，并不適合作為血漿mi R－122的內(nèi)參校正基因。盡管有實驗使用外源的基因（如線蟲mi R－39）作為校正基因，但因mi R在血液循環(huán)中主要以膜性結(jié)構(gòu)包裹或以蛋白結(jié)合的形式存在，如mi R－122主要以 Argonaute2－mi R－122的形式存在［22－23］，而外源合成或純化的校正基因加入血液后可能與內(nèi)源mi R的提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率以及擴(kuò)增效率不同，達(dá)不到內(nèi)參基因校正的目的，因此，本實驗使用了前期工作篩選的在急性肝損傷模型中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源性基因mi R－103對結(jié)果進(jìn)行校正，保證了mi R－122定量檢測結(jié)果的可靠性［14］。

對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠肝損傷與臨床肝損傷病理過程極為相似，因此本實驗采用了常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥對乙酰氨基酚制造大鼠急性肝損傷，并且使用在以往的研究中均未發(fā)現(xiàn)其對肝有影響的0.5%CMC－Na作為助溶劑［24］。本實驗結(jié)果表明，mi R－122在對乙酰氨基酚1250 mg·kg－1給藥后1.5 h就有顯著性升高，對乙酰氨基酚625 mg·kg－1給藥后6 h有顯著性升高，均早于肝損傷評價“金標(biāo)準(zhǔn)”GPT升高，這與 Wang等［10］使用的小鼠急性肝損傷模型所得結(jié)論一致。另外，肝損傷大鼠血漿mi R－122的升高幅度較傳統(tǒng)指標(biāo)更大，因此，血漿mi R－122是肝損傷檢測更靈敏的指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明，血漿mi R－122與肝損傷傳統(tǒng)指標(biāo)血清轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢基本相似，但是血漿mi R－122達(dá)峰時間及開始下降時間均早于血清GPT和GOT的變化，這可能與血漿mi R－122與血清轉(zhuǎn)氨酶的半衰期不同所致。與肝組織病理學(xué)結(jié)果的比較顯示，出現(xiàn)病理改變時血漿中mi R－122的表達(dá)顯著性升高，并且隨著肝損傷的加重而持續(xù)升高；肝組織病理改變出現(xiàn)恢復(fù)時，血漿mi R－122的表達(dá)水平立即下降，與肝損傷的程度呈一致性。

因此，結(jié)合血清生化指標(biāo)GPT，GOT及肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，通過對血漿mi R－122在大鼠急性肝損傷血漿中動力變化趨勢的分析，得知血漿mi R－122在對乙酰氨基酚給藥后的含量變化呈劑量依賴性，且在對乙酰氨基酚給藥后的12 h內(nèi)含量變化呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性。較傳統(tǒng)指標(biāo)升高幅度大，能更早檢測到肝損傷；與組織病理改變一致。因此，血漿mi R－122的變化與肝組織損傷密切相關(guān)，對肝損傷的發(fā)生、發(fā)展有良好的預(yù)測和預(yù)后能力。鑒于肝損傷的發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，將血漿mi R－122與肝損傷的其他檢測指標(biāo)組合使用，有望顯著提高診斷的靈敏性和準(zhǔn)確性。

總之，相對于成分比較復(fù)雜，血液中易降解和檢測技術(shù)局限的潛在的蛋白生物標(biāo)志物，循環(huán)mi R－122在肝組織中高表達(dá)，在其他組織中表達(dá)很低甚至檢測不到，種屬間高度保守，血液中主要以Argonaute2－mi R－122形式存在從而抵制RNA酶的降解［22］，可以使用特異性強、靈敏度高和定量準(zhǔn)確的RT－qPCR檢測技術(shù)，因此，循環(huán)mi R－122更有望成為藥物性肝損傷評價的新指標(biāo)。相信隨著更廣泛的臨床前和臨床實驗的驗證以及mi R核苷酸技術(shù)的發(fā)展和推廣，循環(huán)mi R－122將會成為藥物性肝損傷安全評價的一個新的理想的血液學(xué)檢測指標(biāo)。

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