張福全

胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是具有全能性的哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞或原始細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在分化抑制的培養(yǎng)條件下，可以未分化狀態(tài)無(wú)限增殖。近年來(lái)有關(guān)牛類(lèi)ES細(xì)胞分離與克隆的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展[1-2]。筆者為探討添加物和消化液對(duì)牛胚胎干細(xì)胞克隆效率的影響，通過(guò)從牛鮮胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）中分離獲得牛類(lèi)ES細(xì)胞后進(jìn)行克隆，在培養(yǎng)細(xì)胞中添加胰島素生長(zhǎng)因子和消化液，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 牛胚采集 在自然發(fā)情期，對(duì)健康經(jīng)產(chǎn)黑白花奶牛母進(jìn)行人工受精后68 d經(jīng)非手術(shù)方法從牛子宮取胚胎。將待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 鹽酸利多卡因麻醉。按規(guī)定方法在沖洗兩側(cè)子宮角。沖出的胚胎要在立體顯微鏡下檢查。在100倍實(shí)體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調(diào)、分裂球的大小、均勻度、細(xì)胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等[3-4]。

1.2 溶液配制 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM+0.1 mM 2-mercaptoethanol（在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的血清及各種細(xì)胞因子）；細(xì)胞基礎(chǔ)消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基礎(chǔ)上，兩者濃度有所調(diào)整）。

1.2.1 飼養(yǎng)層制備 選取新生健康黑白花牛犢睪丸制備成纖維細(xì)胞，取3代內(nèi)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MEF， 終濃度10μg/ml 絲裂霉素C處理 3.5 h， D-PBS充分洗滌，消化細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，種植在經(jīng) 0.1%明膠包被的4孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用，用前更換成胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 胚胎處理和胚胎培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室溫下培養(yǎng)牛胚胎及ES細(xì)胞。

1.2.3 ICM初次傳代 將ICM細(xì)胞體外培養(yǎng)6~7 d后，當(dāng)細(xì)胞繁殖到一定數(shù)目時(shí)，選擇未分化的細(xì)胞進(jìn)行傳代。操作如下：用玻璃針剝離覆蓋在ICM表面的滋養(yǎng)層細(xì)胞后挑出ICM，用PBS洗滌液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中處理后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15%的血清培養(yǎng)液中，制備細(xì)胞團(tuán)懸混液。培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 牛ES細(xì)胞繼代克隆 ICM細(xì)胞培養(yǎng)35 d后，飼養(yǎng)層表面可出現(xiàn)類(lèi)似ES細(xì)胞的集落。棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌集落，再用玻璃針剝脫隆起明顯、排列緊密的ES細(xì)胞集落，再用毛細(xì)吸管將集落移入培養(yǎng)液中。

1.3 研究方法 在DMEM培養(yǎng)基中加入10 ng/ml的IGF（設(shè)為IGF組）觀察牛ES細(xì)胞的克隆結(jié)果與未加IGF（設(shè)為對(duì)照組）時(shí)做比較，在離散ICM和ES集落時(shí)，分別用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A組）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B組），作用時(shí)間控制為2 min，溫度37 ℃。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同條件對(duì)牛ES細(xì)胞克隆的影響情況，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同條件對(duì)牛ES細(xì)胞克隆的影響

3 討論

胚胎干細(xì)胞具有全能性，能再體外條件下分化為各器官系統(tǒng)細(xì)胞，亦可在分化抑制的情況下進(jìn)行未分化狀態(tài)克隆，胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、嵌合體的制作和克隆動(dòng)物的生產(chǎn)，目前有關(guān)牛胚胎克隆的研究取得了重大進(jìn)展[4-5]。為探討不同條件對(duì)牛ES細(xì)胞克隆的影響，筆者探討了在不同濃度消化液及在胰島素生長(zhǎng)因子作用下，牛ES細(xì)胞克隆的變化。牛ES細(xì)胞在以上配置的培養(yǎng)液中培養(yǎng)形成ES細(xì)胞集落胚數(shù)/枚ES 2枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)2代。在培養(yǎng)液中加入10 ng/ml的IGF牛ES細(xì)胞集落胚數(shù)為3枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)4代，可見(jiàn)IGF對(duì)牛ES細(xì)胞克隆有促進(jìn)作用。在ICM細(xì)胞與ES細(xì)胞分離時(shí)用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液處理2 min，形成ES細(xì)胞集落胚數(shù)/枚ES 9枚細(xì)胞最大傳代數(shù)4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分離牛ES細(xì)胞集落胚數(shù)為8枚，細(xì)胞最大傳代數(shù)4代。因此，在分離ICM細(xì)胞和ES細(xì)胞時(shí)注意，選擇適當(dāng)濃度的消化液，且作用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)[6-8]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可得出在進(jìn)行牛ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可利用一定的添加物促進(jìn)ES細(xì)胞克隆，促進(jìn)其繁殖，而對(duì)于分離ICM和ES細(xì)胞的消化液，須嚴(yán)控其濃度和作用時(shí)間。

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