張國君，劉卓剛*，張 哲

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除作為常規(guī)治療方法已被廣泛使用，但手術(shù)對于晚期腫瘤效果不佳，因此，藥物輔助治療被寄予厚望。蛋白酶及其抑制劑與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且新的參與因子、蛋白酶及其抑制劑可作為多種腫瘤患者臨床治療的重要指標［1］，因此，針對蛋白酶的抑制已成為腫瘤治療的新的重要靶點。pp242是一種新型的mTOR抑制劑，可以抑制多種腫瘤的生長，如乳腺癌［2］、結(jié)腸癌［3］等，且具有抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制侵襲能力，抑制腫瘤血管生成等多種作用。本研究探討pp242對膀胱癌T24細胞系的增殖及侵襲的影響，檢測pp242對膀胱癌發(fā)生發(fā)展可能起到的作用。

1 儀器與試劑

儀器:酶標儀(美國BioRad公司);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。試劑:pp242(美國Selleckchem公司);T24膀胱癌細胞系(中國科學院細胞庫);CCK-8試劑盒(碧云天公司);transwell板(美國Corning公司);matrigel基底膜膠(美國BD公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國invitrogen公司);胎牛血清(美國TBD公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及干預 T24細胞置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。pp242溶于DMSO，－20℃保存，使用時用RPMI-1640稀釋至需要濃度。對照組不加入pp242。處理組按實驗檢測項目不同加入50、100、200、500 nM pp242并分別接種細胞24 h進入對數(shù)生長期后加藥，每天換液。

2.2 腫瘤細胞生長抑制率檢測 采用CCK-8比色法，T24細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔加100 μL含105個細胞，貼壁培養(yǎng)24 h后，每孔再加入100 μL培養(yǎng)液，使pp242終濃度為50、100、200、500 nM，每孔設(shè)3個復孔并設(shè)對照孔(加細胞不加藥物)和凋零孔(加培養(yǎng)液不加細胞)，培養(yǎng)48 h后每孔加CCK-8 20 μL，再培養(yǎng)1 h，用酶標儀測波長490 nm的吸光度值(OD值)。腫瘤細胞生長抑制率(IR)=(1-實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%。

2.3 體外侵襲實驗 將matrigel按1∶3比例稀釋后，每孔40 μL均勻地鋪在聚碳酸酯膜上(24孔板，8 μm 孔徑)，37 ℃成膠30 min，置紫外燈照射過夜，實驗前再次成膠30 min。細胞消化、計數(shù)，用1640懸浮密度為 4×105/mL，每個小室內(nèi)200 μL細胞懸液，接種到成膠的小室內(nèi)，用含5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。聚碳酸酯膜下層加入600 μL的10%培養(yǎng)基加入每個孔的下層液中作為誘導物，培養(yǎng)24 h。用棉球擦去matrigel膠，將已經(jīng)穿膜的細胞用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定，20 min，4℃;洗2次，風干加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍。隨機5個視野觀察，計數(shù)每個視野的細胞數(shù)，取平均數(shù)，重復3次試驗。侵襲抑制率=(1-實驗組穿膜細胞平均數(shù)/對照組穿膜細胞平均數(shù))×100%。

2.4 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行t檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測pp242對T24細胞增殖活性的影響 隨著藥物濃度的增加，對T24細胞有明顯的抑制效果，在 pp242濃度為200～500 μmol/L時，細胞的增殖活性明顯下降(P＜0.01)，其余兩組與對照組相比，其對細胞的增殖活性影響不明顯(P＞0.05)(見表1)。

表1 pp242干預后T24細胞生長抑制率(%，±s)

表1 pp242干預后T24細胞生長抑制率(%，±s)

注:*與前一濃度比較，P＜0.01

組別 濃度(μmol/L) 抑制率(%)對照組0 pp242 組 50 15.0 ±0.86 100 22.4 ±0.44 200 46.6 ±0.54*500 56.7 ±0.68*

3.2 transwell實驗檢測pp242對T24細胞侵襲能力的影響 隨著藥物濃度的增加，對T24細胞侵襲有明顯的抑制，在 pp242濃度為 200～500 μmol/L時，細胞的侵襲能力明顯被抑制(P＜0.01)，其余兩組與對照組相比，其對細胞的侵襲能力影響不明顯(P＞0.05)(見表2)。

表2 pp242干預后T24細胞侵襲能力的影響

4 討論

mTOR是一種細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞生長和代謝的重要激酶，雷帕霉素是有效的 mTOR抑制劑。mTOR存在2種復合物:mTORC1和mTORC2。其中 mTORC2對雷帕霉素不敏感［4］。pp242是Shokat研究小組開發(fā)的一種新型的mTORC抑制劑，作用于mTOR的ATP結(jié)合位點，因此，能同時抑制mTORC1和mTORC2的催化特性［5-6］。pp242較雷帕霉素能更充分地抑制4EBP-1的磷酸化，為研究mTOR信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的地位提供了很好的方法［7］。

本研究中，CCK-8結(jié)果顯示，隨著pp242濃度的升高和作用時間延長，T24細胞生長抑制率逐漸升高，即pp242對T24細胞株具有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。

腫瘤的惡性程度體現(xiàn)在腫瘤細胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力［8］。因此，更好地抑制腫瘤的侵襲能力，也是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的一種途徑。本研究通過transwell法檢測藥物作用后的腫瘤細胞侵襲能力，結(jié)果顯示，pp242具有抑制T24細胞侵襲的作用，處理組與對照組相比，穿過基質(zhì)膜的細胞數(shù)量明顯減少，且呈劑量依賴性。筆者前期實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，mTOR復合物在膀胱癌發(fā)病機制中起著重要作用。本研究證實，pp242作為 mTORC1和mTORC2的抑制劑，能抑制細胞的增殖和侵襲能力，是一種很有潛力的抗腫瘤藥物，其在mTOR信號通路中的作用機制是我們未來的研究重點。

［1］ Horiguchi Y，Kuroda K，Nakashima J，et al.Antitumor effect of a novel nuclear factor-kappa B activation inhibitor in bladder cancer cells［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2003，3(6):793-798.

［2］ Li H，Lin J，Wang X，et al.Targeting of mTORC2 prevents cell migration and promotes apoptosis in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，134(3):1057-1066.

［3］ Blaser B，Waselle L，Dormond-Meuwly A，et al.Antitumor activities of ATP-competitive inhibitors of mTOR in colon cancer cells［J］.BMC Cancer，2012，12:86.

［4］ Hoang B，Benavides A，Shi Y，et al.The PP242 mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor activates extracellular signalregulated kinase(ERK)in multiple myeloma cells via a target of rapamycin complex 1(TORC1)/eukaryotic translation initiation factor 4E(eIF-4E)/RAF pathway and activation is a mechanism of resistance［J］.J Biol Chem，2012，287(26):21796-21805.

［5］ Feldman ME，Apsel B，Uotila A，et al.Active-site inhibitors of mTOR targetrapamycin-resistantoutputsofmTORC1 and mTORC2［J］.PLoS Biol，2009，7(2):e38.

［6］ Wang BT，Ducker GS，Barczak AJ，et al.The mammalian target of rapamycin regulates cholesterol biosynthetic gene expression and exhibits a rapamycin-resistant transcriptional profile［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(37):15201-15206.

［7］ Zeng Z，Shi YX，Tsao T，et al.Targeting of mTORC1/2 by the mTOR kinase inhibitor PP242 induces apoptosis in AML under conditions mimicking the bone marrow microenvironment.Blood，2012，［Epub ahead of print］

［8］ Hagedorn EJ，Sherwood DR.Cell invasion through basement membrane:the anchor cell breaches the barrier［J］.Curr Opin Cell Biol，2011，23(5):589-596.