[摘要] 目的 應(yīng)用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定胎盤中的新潔爾滅。采用甲醇浸泡溶解，10%高氯酸沉淀蛋白的方法，提取樣品后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。方法 色譜柱：用Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（53：20：27）；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；流速：0.85 mL/min。結(jié)果 在2.0～10.0μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r：0.9999），回收率為95.7% ～99.6%，日內(nèi)RSD為1.4% ～1.8%，日間RSD為1.5%～2.1%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，完全符合中國(guó)藥典2010版規(guī)定，可作為臨床檢測(cè)方法。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；新潔爾滅；胎盤

[中圖分類號(hào)] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2013）01（c）-0015-02

新潔爾滅（Bromogeramine），別名為苯扎溴銨、溴化芐烷銨，常溫下為白色或淡黃色膠狀體或粉末， 低溫時(shí)可能逐漸形成蠟狀狀固體，帶有芳香氣味， 但嘗味極苦。易溶于水， 乙醇， 微溶于丙酮， 不溶于乙醚， 苯， 水溶液呈堿性反應(yīng)。近年來，在一些臨床實(shí)踐中該藥被用于引產(chǎn)， 將新潔爾滅注入羊膜腔內(nèi)，引起胎兒死亡的同時(shí)能引起子宮收縮，臨床引產(chǎn)胎兒死亡率可達(dá)100%，引產(chǎn)成功率可達(dá)95%以上，常為私人醫(yī)院或小診所中作為流產(chǎn)藥物用于中期妊娠引產(chǎn)。一直以來，由于對(duì)非法鑒定胎兒性別，私自進(jìn)行藥物流產(chǎn)缺乏科學(xué)的檢測(cè)方法，難以準(zhǔn)確認(rèn)定，使得由上述人為原因所造成的男女性別比例嚴(yán)重失衡現(xiàn)象一直無法得到很好解決。生物樣品中新潔爾滅的準(zhǔn)確定性定量方法報(bào)道甚少，且難以套用[1-2]，因此本實(shí)驗(yàn)建立反相高效液相色譜紫外法測(cè)定生物樣品中新潔爾滅的方法，該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)單，可考慮作為仲裁分析的常規(guī)方法。

1 儀器與試藥

變色龍色譜工作站，UltimateTM3000全自動(dòng)高效液相色譜儀，過濾裝置（天津華鑫儀器廠）；萬分之一電子分析天平（亞太電子天平廠）；新潔爾滅標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)100394-189715，純度99.99%）；庚烷磺酸鈉為HPLC專用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：用Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇一乙腈一水（53：20：27）；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速：0.85 ml· min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)本的前處理

胎盤標(biāo)本處理：取胎膜5.0 g，加入甲醇2.0 mL，浸泡溶解1.0 h，渦旋震蕩10 min，以5000 r·min-1速率離心10 min。精密吸取上清液1.0 mL，再加入10%高氯酸0.5 mL，以有機(jī)膜0.22 μm過濾，即得胎盤樣品供試液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖[3]。

2.3 溶液制備

2.3.1 新潔爾滅標(biāo)準(zhǔn)溶液 新潔爾滅貯備液100 μg·mL-1，具體制取方法：精密稱取0.010 0 g新潔爾滅標(biāo)準(zhǔn)品，將其用甲醇溶解定容至100 mL的容量瓶中，即可。

2.3.2 新潔爾滅系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 胎盤標(biāo)準(zhǔn)樣：同樣本前處理，將被測(cè)樣換成空白樣并在其中加標(biāo)，配制新潔爾滅的質(zhì)量濃度分別為1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00及10.00μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列樣。

胎盤質(zhì)控樣：同樣本前處理，將被測(cè)樣換成空白樣，并加入對(duì)照品，使新潔爾滅的質(zhì)量濃度分別為2.00 μg·mL-1，5.00μg·mL-1和8.00 μg·mL-1的低、中、高濃度質(zhì)控樣。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專屬性

如圖1至圖4所示，新潔爾滅與胎盤中的干擾物質(zhì)呈現(xiàn)完全分離狀態(tài)，表明專屬性好。

3.2 線性關(guān)系及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各取20.0 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以平均峰面積（Y）對(duì)濃度（X）作圖，標(biāo)準(zhǔn)系列得一直線，其回歸方程為y=4.65×103X-1.95×102，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，線性范圍為2.0～10.00 μg·mL-1。胎盤標(biāo)準(zhǔn)系列得一回歸方程為y=3.68×103X-1.05×102，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。線性范圍為2.0～10.0 μg·mL-1的直線。

3.3 回收率與精密度

3.3.1 回收率和日內(nèi)精密度測(cè)試 1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定濃度為2.0 μg·mL-1， 5.0 μg·mL-1，8.0 μg·mL-1生物模擬樣各3次，平均回收率分別為95.7%、99.0%和99.6%，RSD% 分別為1.8%、1.5%與1.4%，說明準(zhǔn)確度及日內(nèi)精密度良好。見表1。

3.3.2 日間精密度測(cè)試實(shí)驗(yàn) 連續(xù)3日重復(fù)測(cè)定濃度為2.0，5.0，8.0 μg·mL-1的生物模擬樣，平均回收率分別為97.5%、99.3%和99.5%，RSD%分別為2.1%、1.6和1.5%，表明準(zhǔn)確度、日間精密度良好。見表2。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為一種季銨鹽陽離子表面活性廣譜殺菌劑活力強(qiáng)，對(duì)皮膚和組織無刺激性，對(duì)金屬、橡膠制品無腐蝕作用。1：1000溶液廣泛用于手、皮膚、粘膜、器械等的消毒。可長(zhǎng)期保存效力不減，故測(cè)試和實(shí)驗(yàn)中結(jié)果比較穩(wěn)定[4]。按結(jié)果的相對(duì)偏差≤5%控制。取2 μg·mL-1新潔爾滅水溶液和胎盤基質(zhì)樣，分別在放置0 h、3 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后取樣，每個(gè)樣品測(cè)1次。結(jié)果顯示，新潔爾滅的水溶液和胎盤基質(zhì)液相對(duì)偏差均≤5%。

3.5 供試品測(cè)定

因死胎或有早產(chǎn)癥狀妊娠3～7個(gè)月入孕婦20人作為研究對(duì)象，懷疑其為私自非法使用流產(chǎn)藥物墮胎。此20人流產(chǎn)后均將其胎盤標(biāo)本送檢。分析其樣品結(jié)果為2人出現(xiàn)與新潔爾滅保留時(shí)間幾乎一致的色譜峰，其濃度分別為（1.8±0.03） μg·mL-1、（2.1±0.05） μg·mL-1。

4 討論

4.1 樣品前處理方法選擇

由于胎盤中脂溶組份較多，擬排除的內(nèi)源性干擾物主要為水溶性物質(zhì)，故提取溶劑多選擇有機(jī)溶劑。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]正丁醇一步法提取樣本用的是熒光檢測(cè)器，對(duì)色譜峰存在干擾，而且正丁醇粘度較大，不易清洗，易造成交叉污染。而該研究采用紫外檢測(cè)器，在樣品制備時(shí)以甲醇浸泡溶解樣品（甲醇有沉淀析出蛋白的功能），由于胎盤中含有較多胎脂等脂質(zhì)性物質(zhì)，如果蛋白析出不完全或其他雜質(zhì)析出不干凈，會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果，因而，加入10%的高氯酸進(jìn)一步沉淀蛋白，可使樣本處理更徹底，提取后的基質(zhì)液中的雜質(zhì)濃度明顯地減少，有利于樣本分離檢測(cè)。

4.2 流動(dòng)相選擇

經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C18色譜柱測(cè)定新潔爾滅門峰拖尾較嚴(yán)重。為改善此狀況，通過改變流動(dòng)相配比多次探索拖尾狀況，后加入庚烷磺酸鈉0.05 mmol·L-1，調(diào)PH5.5，實(shí)驗(yàn)前將含水較多的流動(dòng)相乙腈一水（體積比為35：65）按0.1 mL·mL-1的低流速過柱2～3 h能一定程度上起到改善峰型及拖尾現(xiàn)象[5]。

該實(shí)驗(yàn)經(jīng)方法學(xué)考察和臨床樣本測(cè)定結(jié)果證實(shí)，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、快速、靈敏、重現(xiàn)性好，為新潔爾滅體液組織藥物濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了可靠的依據(jù)。

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（收稿日期：2012-07-28）