[摘要] 目的 探討阿侖膦酸鈉(ALN)對體內(nèi)成骨的影響。方法 選擇3月齡SD大鼠20只,在每個(gè)顱骨上制備4個(gè)極限全層骨缺損,分別填入納米羥基磷灰石(HA, A組),納米羥基磷灰石-阿侖膦酸鈉(HA-ALN),依據(jù)ALN質(zhì)量比例分為B組(1 mg/g)、C組(2 mg/g)、D組(4 mg/g)。術(shù)后2周、4周、8周和12周各隨機(jī)處死5只。切取顱骨做大體觀察,X線檢測及組織學(xué)觀察,比較兩組缺損修復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果 術(shù)后2周,實(shí)驗(yàn)組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),術(shù)后4周兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組,術(shù)后8周和12周組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 nHA-ALN在體內(nèi)促進(jìn)骨缺損修復(fù)效果優(yōu)于nHA,以2 mg/g組效果最顯著。
[關(guān)鍵詞] 阿侖膦酸鈉;納米羥基磷灰石;骨缺損
[中圖分類號(hào)] R683;R580 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742(2013)01(c)-0001-02
骨量不足及骨缺損,是臨床難題之一。ALN已經(jīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松多年,國內(nèi)外大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在一定濃度下,其對破骨細(xì)胞有抑制作用,同時(shí)對成骨細(xì)胞有促進(jìn)作用,可以推測ALN在一定濃度下具有促進(jìn)成骨作用。然而體內(nèi)外的生理環(huán)境差異較大,因此該實(shí)驗(yàn)以納米羥基磷灰石(nHA)為載體,制備緩釋體系,直接探討該藥物在體內(nèi)對骨缺損修復(fù)的影響。該研究于2011年12月—2012年5月在濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)校區(qū)進(jìn)行。
1 資料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
清潔級(jí)3月齡SD雄性大鼠,nHA為納米級(jí)粉末,ALN白色粉末,純度>99.9%。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 nHA-ALN的制備 將清洗并消毒nHA倒入一定量超純水中,超聲波清洗機(jī)80 W,40 kHz,1.5 h,加入適當(dāng)質(zhì)量的ALN,漩渦振蕩器震蕩3 min,真空干燥成粉末。
1.2.2 手術(shù)步驟 3月齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。40 g/L水合氯醛以10 mL/kg體重腹腔注射麻醉。固定大鼠,常規(guī)顱頂備皮消毒,自眼眶后緣至耳后緣沿正中線剪開皮膚及皮下組織,沿中線剪開骨膜并剪除術(shù)區(qū)骨膜。在無菌生理鹽水冷卻下,用牙科鉆機(jī)做4個(gè)直徑5 mm全層骨缺損,缺損之間間隔2~3 mm,勿損傷硬腦膜。4個(gè)缺損分別填充nHA (A組)和 nHA-ALN,其中nHA-ALN以ALN的質(zhì)量比例分為3個(gè)組:B組(1 mg/g)、C組(2 mg/g)、D組(4 mg/g)。高度與周圍組織面平齊,提拉創(chuàng)口邊緣皮膚,嚴(yán)密縫合。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用抗生素。
1.2.3 大體觀察 術(shù)后2周、4周、8周和12周分別處死5只大鼠,完整切取顱骨,觀察缺損愈合情況和新生骨質(zhì)地。
1.2.4 X線檢測 取出顱骨后,即刻拍攝X線片,調(diào)整放射源,使放射源距離感光片40 cm,放射量為0.70,使X線垂直穿透顱骨。
1.2.5 組織學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定24 h,流水沖洗12 h,5%HNO3脫鈣至針刺入軟組織,梯度酒精脫水包埋,制作5 um厚切片,HE染色,中性樹膠封片。100倍鏡下每個(gè)時(shí)間段每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算新生骨占視野的百分比。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行析因設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析和單因素方差分析,數(shù)據(jù)以(x±s)形式表示。
2 結(jié)果
2.1 大體觀察
術(shù)后2周,缺損邊緣參差不齊,組間無明顯差異,未見明顯縮小;術(shù)后4周,新生骨組織較多,硬度較正常骨組織低,C組缺損面積明顯小于其他組;術(shù)后8周和12周,缺損面積進(jìn)一步縮小,C組缺損始終小于其他組,C組有缺損完全閉合者,A組未出現(xiàn)。
2.2 X線檢測
術(shù)后2周,組間缺損無明顯區(qū)別,缺損邊緣變模糊,不規(guī)則;術(shù)后4周、8周和12周,缺損逐漸修復(fù),C組修復(fù)速度快于其他組。術(shù)后12周,部分C組僅X線可見缺損痕跡。
2.3 組織學(xué)觀察
術(shù)后2周,各組剩余缺損面積組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后4周,A組與C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040),C組與D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043),其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后8周和12周,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
整體統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),濃度因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.656, P=0.005),A組與C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),C組與D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043),B組與C組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056),其他組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3 討論
ALN是臨床上用于治療骨質(zhì)疏松藥物的有效成分,其基本原理是ALN進(jìn)入體內(nèi)后快速吸附并沉積于骨缺損邊緣,與暴露的羥基磷灰石結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞活性,減少骨量丟失。以往大量實(shí)驗(yàn)采用多次注射或頻繁口服給藥,較為繁瑣,而且口服ALN的吸收利用率僅為1%左右,造成藥物的極度浪費(fèi),口服注意事項(xiàng)較多,并存在燒傷食道等嚴(yán)重并發(fā)癥。所以,本實(shí)驗(yàn)采用一次性緩釋給藥和同一動(dòng)物左右兩側(cè)的對照,既避免了吸收率不一引起的最終給藥量不同和繁瑣的程序,又排除了個(gè)體差異造成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏倚。
另有關(guān)研究顯示,nHA-ALN復(fù)合材料具有特殊的緩釋性能,實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合后幾乎不以溶出的方式釋放藥物,只有最初24小時(shí)釋放少量處于游離狀態(tài)的ALN,之后不再釋放[1],在新骨生成并礦化的過程中,ALN隨著nHA的被利用而發(fā)揮其藥理作用,增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性,加速新骨形成,從而縮短骨缺損的修復(fù)時(shí)間。而且,正常骨組織的主要無機(jī)成分就是羥基磷灰石,所以nHA生物相容性好,不會(huì)引起免疫排異反應(yīng),使用更加安全,在骨缺損的治療上,曾經(jīng)有單獨(dú)填充nHA粉末的做法,也有一定的效果。此外,nHA對ALN的吸附能力較強(qiáng),容易實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合,并且不影響AL的藥理性質(zhì),兩種材料按照一定比例復(fù)合使用可以改善生物相容性[2],并對骨組織再生有協(xié)同作用,是一種良好的緩釋體系[3]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用nHA作為載體,與ALN實(shí)現(xiàn)化學(xué)結(jié)合并填充入極限骨缺損,隨著nHA被吸收用于骨缺損修復(fù)的進(jìn)行,ALN得以持續(xù)發(fā)揮作用,與新骨的形成同步緩釋,而不會(huì)像其他一些緩釋材料釋放藥物速度與組織需求不協(xié)調(diào)。
大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ALN在一定濃度范圍內(nèi)時(shí),對成骨細(xì)胞功能有促進(jìn)作用,同時(shí)對破骨細(xì)胞活性有抑制作用[4],因此對于濃度問題,應(yīng)給予嚴(yán)密關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選取了3個(gè)質(zhì)量比例的nHA-ALN復(fù)合材料,作為骨缺損的修復(fù)材料,在顱骨的缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中取得了很好的干預(yù)效果。
本實(shí)驗(yàn)顯示,術(shù)后2周,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示了ALN在骨損傷的早期應(yīng)用可能不會(huì)影響骨修復(fù)[5];術(shù)后4周時(shí),A、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015),其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,C、D組間差異有明顯趨勢(P=0.107),干預(yù)措施顯現(xiàn)了一定的效果,nHA聯(lián)合ALN使用的干預(yù)效果優(yōu)于nHA單獨(dú)使用; 術(shù)后8周、12周,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是具體數(shù)值上看,C組仍然優(yōu)于其他各組。本實(shí)驗(yàn)只模擬了小囊腫摘除后造成的骨缺損,和不承重部位的坑狀骨缺損。因此,下一步可以考慮將nHA-ALN加工成為骨支架材料,以期更好地解決消耗速度和承重的問題。
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(收稿日期:2012-09-03)