郭睿等

摘要：檸檬酸是能量代謝的產(chǎn)物，只有在阻止正常代謝進(jìn)行的情況下檸檬酸才可能大量積累。20世紀(jì)30年代人們已經(jīng)初步掌握了黑曲霉（Aspergillus niger）檸檬酸的發(fā)酵條件并進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，然而對(duì)檸檬酸積累機(jī)理的研究還不是很透徹，黑曲霉檸檬酸積累引起了眾多研究者的關(guān)注。另外，一些新的生物技術(shù)如基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也為黑曲霉檸檬酸代謝的深層研究提供了可能。綜述了黑曲霉檸檬酸代謝過(guò)程中己糖的輸送、糖酵解和能荷調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：黑曲霉（Aspergillus niger）；檸檬酸積累；代謝機(jī)制

中圖分類號(hào)：TQ921+.1；TS261.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1489-04

檸檬酸（2-羥基-丙烷-1，2，3-三羧酸）最初被認(rèn)為是柑橘屬植物的一種組分，作為三羧酸循環(huán)（TCA）的中間產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)近70年。檸檬酸結(jié)合低毒、可口性和美味于一體，已成為一種廣泛的食品添加劑。并且檸檬酸能夠螯合鐵、銅等重金屬離子，因此在金屬離子催化的氧化反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)油、脂肪和抗壞血酸的穩(wěn)定性具有重要的作用，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中[1]。

目前，檸檬酸全世界消耗量已達(dá)120萬(wàn)t，年產(chǎn)量達(dá)160萬(wàn)t，市場(chǎng)貿(mào)易量為90萬(wàn)t以上，且每年以7%的速度遞增。雖然檸檬酸有一小部分在酵母發(fā)酵中產(chǎn)生，但大多數(shù)發(fā)生在真菌黑曲霉（Aspergillus niger）中。數(shù)十年來(lái)，黑曲霉積累檸檬酸的生化代謝機(jī)制引起了基礎(chǔ)科學(xué)和應(yīng)用科學(xué)研究者的廣泛關(guān)注，并開(kāi)展了大量研究。本文結(jié)合近些年來(lái)黑曲霉合成檸檬酸代謝機(jī)制的研究進(jìn)展，對(duì)其進(jìn)行總結(jié)概括，以求更深入理解其內(nèi)在機(jī)理。

1 黑曲霉合成檸檬酸的途徑

自1940年TCA學(xué)說(shuō)建立以來(lái)，檸檬酸的發(fā)酵機(jī)理逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。Cleland等[2]的研究表明檸檬酸的合成過(guò)程包括葡萄糖酵解的分解代謝。由于檸檬酸合成酶位于線粒體中，合成的草酰乙酸并不立即參與檸檬酸合成酶的反應(yīng)，而是首先被細(xì)胞質(zhì)中的蘋(píng)果酸脫氫酶催化形成蘋(píng)果酸，進(jìn)而通過(guò)蘋(píng)果酸-檸檬酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體（圖1）。由圖1可知，檸檬酸是整個(gè)TCA代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物。在檸檬酸積累過(guò)程中，只有當(dāng)黑曲霉順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，而檸檬酸合成酶活性很高時(shí)才有利于檸檬酸的大量積累。

2 黑曲霉合成檸檬酸的代謝調(diào)控

2.1 葡萄糖的吸收

對(duì)于檸檬酸發(fā)酵，由于黑曲霉在以葡萄糖和果糖為碳源時(shí)能夠很好地生長(zhǎng)，所以通常采用己糖為碳源。對(duì)于工業(yè)用蔗糖，一般采用在低pH條件下高溫滅菌或者利用細(xì)胞外的轉(zhuǎn)化酶水解為單糖。葡萄糖吸收主要依靠?jī)煞N親和性不同的運(yùn)載體的被動(dòng)擴(kuò)散作用。Vankuyk等[3]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由mstA編碼的高親和性的運(yùn)載體，碳源濃度較低時(shí)該高親和性運(yùn)載體就能夠生成，它能夠催化單糖/H+交換，其Km值為25±10 μmol/L，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH降低或者檸檬酸濃度升高會(huì)影響該運(yùn)載體的活性。

葡萄糖達(dá)到15%（W/V）時(shí)，黑曲霉內(nèi)除高親和性運(yùn)載體外，還生成一種低親和性的運(yùn)載體，該低親和性運(yùn)載體受pH和檸檬酸的影響比高親和性運(yùn)載體要小。低親和性運(yùn)載體的Km值為360 μmol/L，遠(yuǎn)比高親和性運(yùn)載體大。借助同源構(gòu)巢曲霉的基因分析發(fā)現(xiàn)，低親和力運(yùn)載體可能有mstE基因編碼，mstE基因的表達(dá)隨葡萄糖濃度的升高而加強(qiáng)。

需要說(shuō)明的是，這兩種運(yùn)載體提供的是促進(jìn)擴(kuò)散而非主動(dòng)運(yùn)輸。促進(jìn)擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸均與底物葡萄糖濃度呈非線性關(guān)系，但是簡(jiǎn)單擴(kuò)散卻是線性關(guān)系。Wayman等[4]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄糖的吸收率與葡萄糖濃度為簡(jiǎn)單的線性關(guān)系而不是非線性模式。即使底物中檸檬酸的濃度很高，且這種高濃度的檸檬酸對(duì)運(yùn)載體有抑制作用，但葡萄糖吸收的速率卻不受限制[5]。

2.2 糖酵解的調(diào)節(jié)

發(fā)酵初期磷酸戊糖途徑占主要部分，黑曲霉生長(zhǎng)期間幾乎全部TCA酶的含量都很高，此時(shí)大量的葡萄糖被用于黑曲霉菌株的生長(zhǎng)。24 h后開(kāi)始有檸檬酸生成，如圖1所示，在檸檬酸發(fā)酵初期，檸檬酸通過(guò)TCA循環(huán)轉(zhuǎn)換為α-酮戊二酸。NAD-和NADP-專一性異檸檬酸脫氫酶此時(shí)具有很高的活性?？梢钥闯?，檸檬酸積累的最初階段并沒(méi)有阻斷TCA循環(huán)。然而此時(shí)檸檬酸產(chǎn)量比理論值要高，這可能是氨基糖的瞬時(shí)積累及釋放所致[6]。在檸檬酸積累的誘導(dǎo)期間，延胡索酸和異檸檬酸減少，丙酮酸、草酰乙酸和檸檬酸增加。這種中間產(chǎn)物水平的短暫變化主要是因?yàn)棣?酮戊二酸脫氫酶的減少，進(jìn)而導(dǎo)致琥珀酸、延胡索酸的水平降低。同時(shí)由于酶解作用強(qiáng)烈使丙酮酸和草酰乙酸增加，這為檸檬酸的積累提供了條件[7]。

糖酵解的調(diào)節(jié)可以在不同的層面上進(jìn)行：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)；利用特定效應(yīng)因子以及翻譯后修飾調(diào)節(jié)別構(gòu)酶活性[8，9]。對(duì)糖酵解調(diào)節(jié)酶基因的研究表明己糖激酶、葡糖激酶、丙酮酸激酶的合成與菌體外部環(huán)境有關(guān)，將黑曲霉置于葡萄糖和果糖碳源時(shí)能夠顯著激發(fā)轉(zhuǎn)錄過(guò)程并進(jìn)而刺激這些激酶的生成。

2.2.1 己糖激酶和葡萄糖激酶 己糖的磷酸化由己糖激酶和葡萄糖激酶共同作用。但是兩種酶的基因彼此孤立，動(dòng)力學(xué)決定性因素也不同。在激活的碳代謝條件下，兩種酶都可以組成型表達(dá)，只不過(guò)己糖激酶擁有更多的特異性底物。果糖可以被己糖激酶磷酸化，但是反應(yīng)很慢，在細(xì)胞中可以忽略不計(jì)。葡萄糖激酶能夠抵抗不同效應(yīng)因子的抑制，但pH稍微下降即容易被破壞。另外糖濃度低時(shí)，無(wú)論果糖還是葡萄糖均能被己糖激酶磷酸化并且沒(méi)有明顯的先后次序。己糖激酶還可以被6-磷酸海藻糖（一種海藻糖生物合成的中間產(chǎn)物）強(qiáng)烈抑制。但6-磷酸海藻糖只存于發(fā)酵的48 h以內(nèi)，在被cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）磷酸化后即被中性海藻糖酶水解。6-磷酸海藻糖的水解可以使己糖激酶不再受到抑制，大量的果糖和葡萄糖被磷酸化，并可能最終促使磷酸戊糖途徑向糖酵解途徑轉(zhuǎn)變[10]。

2.2.2 磷酸果糖激酶 磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，它催化糖酵解的第一步不可逆反應(yīng)，利用Mg-ATP磷酸化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6二磷酸并釋放副產(chǎn)物Mg-ADP。由于PFK既能保證高的糖酵解通量又能提高細(xì)胞內(nèi)檸檬酸濃度，因而受到眾多研究者的關(guān)注。

磷酸果糖激酶被正常生理濃度的檸檬酸（1～5 mmol/L）所抑制。但是在發(fā)酵條件下，這種抑制作用被許多正向效應(yīng)因子（NH4+，AMP，F(xiàn)ru-2，6-P2）所中和。碳源的濃度也可能對(duì)此有作用，這是因?yàn)樘幱诟邼舛日崽腔蛘咂咸烟侵械暮谇?，其?xì)胞內(nèi)Fru-2，6-P2（磷酸果糖激酶活化因子）濃度同樣會(huì)升高。用1-13C葡萄糖的NMR研究證實(shí)了果糖-6-磷酸為低糖條件下的主控步驟，但在高糖濃度下主控步驟下移到3-磷酸甘油醛脫氫酶[11]。

NH4+能有效解除檸檬酸和ATP對(duì)PFK的抑制。細(xì)胞內(nèi)NH4+的濃度處于生理水平時(shí)，PFK對(duì)檸檬酸不敏感。當(dāng)NH4+被消耗時(shí)溶液的pH會(huì)有所下降，這對(duì)檸檬酸發(fā)酵是有利的。

最近Legi？觢a的研究發(fā)現(xiàn)PFK1翻譯后修飾會(huì)產(chǎn)生一個(gè)短的活性片段。首先通過(guò)特定蛋白酶將分子量為85 u的原蛋白水解得到無(wú)活性的49 u的片段；第二步由cAMP-依賴蛋白激酶（PKA）使蛋白分子磷酸化，從而得到短的有活性的PFK1片段[8，9]。去除具有檸檬酸結(jié)合位點(diǎn)的酶的C末端并保留活性N-末端部分可以使蛋白既能擁有酶的活性的同時(shí)又不受檸檬酸的抑制。與原酶相比，該活性片段被果糖-2，6-二磷酸、AMP和NH4+激活后活性更高，并且對(duì)ATP抑制作用響應(yīng)不明顯。同時(shí)為了避免復(fù)雜的翻譯后修飾自發(fā)進(jìn)行，必須對(duì)活性短的PFK1片段的編碼基因進(jìn)行修飾。Capuder等[12]篩選出能夠改變PFK1活性的短片段然后用谷氨酸代替相應(yīng)的蘇氨酸終止磷酸化。修飾后的基因能夠直接表達(dá)而不受檸檬酸抑制。

2.2.3 丙酮酸激酶 雖然PFK是糖酵解中最復(fù)雜的調(diào)控酶，但通常催化糖酵解的第三步不可逆反應(yīng)的丙酮酸激酶控制細(xì)胞內(nèi)糖酵解的速率。PKIA基因控制編碼丙酮酸激酶，這種酶由分子量為58 u的單體構(gòu)成。酶動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)果糖1，6-二磷酸能夠阻止純化階段丙酮酸激酶的失活。有趣的是，對(duì)丙酮酸激酶有明顯抑制的ATP對(duì)6-磷酸-1-激酶卻沒(méi)有任何抑制，相反活性還略有提高。丙酮酸激酶一直被認(rèn)為是調(diào)控檸檬酸合成階段的重要酶，但是Meixner-Monori等[13]發(fā)現(xiàn)提純后的丙酮酸激酶受到代謝程度的影響很小。并且Ruijter等[14]發(fā)現(xiàn)無(wú)論是單獨(dú)還是同時(shí)擴(kuò)增PFK1和PKIA的基因，檸檬酸積累的產(chǎn)率都沒(méi)有增加。這可能驗(yàn)證了Torres等[15]的計(jì)算——必須同時(shí)至少增加7個(gè)糖酵解酶的活性才能獲得較為顯著的檸檬酸積累。

2.3 能荷調(diào)節(jié)

葡萄糖進(jìn)行糖酵解途徑會(huì)產(chǎn)生一定量的NADH，NADH必須及時(shí)經(jīng)過(guò)電子傳遞轉(zhuǎn)化為NAD+才能保證黑曲霉菌體內(nèi)氧化還原電位的平衡。NADH泛醌氧化還原酶全部失活時(shí)才能使檸檬酸產(chǎn)率提高。這是由于NADH失去的電子經(jīng)過(guò)呼吸鏈會(huì)產(chǎn)生ATP，過(guò)量的ATP會(huì)抑制磷酸果糖激酶的活性，不利于糖酵解的順利進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了有一條正常的呼吸鏈外還有一條受水楊酸氧肟酸 （SHAM）抑制的側(cè)呼吸鏈，黑曲霉發(fā)酵后期檸檬酸的合成主要是通過(guò)側(cè)呼吸鏈完成的，缺氧會(huì)造成側(cè)呼吸鏈不可逆而失活[16]。

在檸檬酸生產(chǎn)階段，大量的NADH通過(guò)側(cè)呼吸鏈被氧化（圖2）。高活性的側(cè)鏈氧化酶將多余的NADH氧化，這樣不僅不會(huì)產(chǎn)生多余的ATP，還能夠保證細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位的平衡。側(cè)鏈氧化酶是在細(xì)胞質(zhì)合成后轉(zhuǎn)移到線粒體中的，Hattori等[17]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸生成時(shí)側(cè)鏈氧化酶僅由側(cè)鏈氧化酶基因（aoxl）的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。

ODonnell等[18]研究了氧壓增強(qiáng)時(shí)側(cè)NADH脫氫酶的作用，發(fā)現(xiàn)增加溶氧含量能夠使活性氧（ROS）濃度和抗氧化酶活性快速提高，也使細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度下降，從而導(dǎo)致ATP下降。過(guò)量的氧環(huán)境加速了細(xì)胞的衰老和死亡。分析認(rèn)為在過(guò)量溶氧條件下為了維持低濃度的ROS，側(cè)NADH脫氫酶的活性顯著增加，但是這也降低了機(jī)體合成蛋白的能力，從而無(wú)法合成足夠的ATP。

3 小結(jié)與展望

荷蘭工業(yè)化學(xué)公司DSM已經(jīng)完成了黑曲霉基因組測(cè)序的工程[19]。黑曲霉基因組約3 390萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)編碼了14 000多個(gè)基因。其中大約6 500個(gè)基因的功能已被確定。未來(lái)，黑曲霉基因組可以用于設(shè)計(jì)DNA芯片，并可用來(lái)鑒定改進(jìn)菌株中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因；有助于發(fā)酵成功。另外還能夠檢測(cè)有害參數(shù)例如Mn2+或者糖濃度以及糖類型對(duì)發(fā)酵的影響。

目前國(guó)內(nèi)黑曲霉積累檸檬酸產(chǎn)量每年都有所提高，但檸檬酸生產(chǎn)時(shí)的糧耗卻居高不下，檸檬酸企業(yè)在發(fā)酵技術(shù)改造研究上的投入也相對(duì)不足，借助基因組學(xué)一些新技術(shù)深入研究黑曲霉發(fā)酵檸檬酸代謝調(diào)節(jié)，可望為培育菌株提供更好的篩選策略。

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