馬雅鴿，趙聲蘭，甫琪森，梁寧利

（1.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.寶雞出入境檢驗檢疫局，陜西 寶雞 721006）

地木耳屬于藍藻門（Cyanophyta），藍藻綱（Cyanophyceae），念珠藻目（Nostocales），念珠藻科（Nostocaceae），念珠藻屬（Nostoc），是念珠藻中的群體型（Colony），藻絲由50～170個營養(yǎng)細胞和異形胞組成[1]。

我國人民對地木耳食用廣泛且歷史久遠，但沒有引起人們足夠的重視。近年來，在世界范圍內(nèi)的野生食物開發(fā)熱潮中，地木耳的研究和開發(fā)才引起人們的重視。研究范圍主要包括：分類和描述、生態(tài)學、營養(yǎng)成分、生理生化、生物活性物質(zhì)、分子生物學、人工培養(yǎng)、產(chǎn)品開發(fā)等[2-3]。在地木耳產(chǎn)品開發(fā)方面的研究，主要集中在蛋白飲料的研究，而對地木耳發(fā)酵產(chǎn)品的研究還少見報道，實驗采用超聲輔助水提制備地木耳提取物后，進行乳酸菌發(fā)酵的研究，為地木耳產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地木耳（Nostoc communeVauch.）分別采自云南昆明松花壩水庫及云南曲靖市富源縣；原料乳為市售歐亞全脂滅菌乳；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）47和嗜熱乳鏈球菌（Streptococcus thermophilus）38均購買自云南省微生物研究所；水（符合GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中要求；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、吐溫-80、K2HPO4·7H2O，乙酸鈉，檸檬酸三銨，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，瓊脂粉等均為市售。

甲苯胺藍染液：稱取0.2g甲苯胺藍，用少量丙酮溶解后以蒸餾水定容至100mL。MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫-80 1.0g/L，K2HPO42.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，MgSO40.2g/L，MnSO40.04g/L，pH值6.2。

1.2 儀器與設備

GHP-9080隔水恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；NikonYS100生物顯微鏡：日本尼康公司；YXQ-LSSOS2高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PHS-3C型pH計：上海儀電分析儀器有限公司；DHG-9240A型干燥箱：上海一恒科技有限公司；SK7210HP超聲清洗儀：上?？茖С晝x器有限公司；雙人單面超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；UX6200H分析天平：北京賽多利斯儀器系列有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地木耳水提物的制備

將地木耳與石英砂按1∶2的比例混勻，研磨15min，然后精確稱取地木耳粉5g，置于500mL錐形瓶中，加入250mL蒸餾水，浸泡30min，90℃超聲破碎15min后，煎煮（武火煮沸，文火保持30min），濾布過濾，濾渣加水（地木耳/水=1∶10，時間30min）煎煮，過濾，濾液合并，4℃以12000×g的離心力離心15min，取上清液，制得地木耳水提物，密封至冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌菌種的活化

取保藏保加利亞乳桿菌和嗜熱乳鏈球菌菌種分別按4%接種量接種于脫脂乳中，41℃～42℃培養(yǎng)，凝乳時取出，制片觀察菌體形態(tài)，保證菌體形態(tài)正常并且無雜菌，用此次活化菌種接種、培養(yǎng)，單菌種各活化1次，然后將兩菌種按1∶1的比例接種于脫脂乳中，總接種量為3%，然后培養(yǎng)，反復活化幾次至菌體活力穩(wěn)定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 地木耳酸奶加工工藝流程

操作要點：量取100mL純奶，原料乳的酸度0.09%乳酸，固形物含量8.1%，脂肪含量3.5%，蛋白質(zhì)含量3.0%，接種10%保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱乳鏈球菌（Streptococcus thermophilus）混合發(fā)酵液，溫度41℃～42℃培養(yǎng)。3h后開始觀察凝乳情況，記錄凝乳時間，完全凝乳后，測其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對其進行感官評定，再4℃冷卻，后熟發(fā)酵24h，取出測定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對其進行感官評定。

1.3.4 地木耳提取物添加量對酸乳品質(zhì)的影響

將地木耳水提物按0%、5%、10%、15%、20%、25%不同的添加量分別加入100mL凝乳之后的酸乳中，再放入4℃冰箱后熟發(fā)酵24h，取出測其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對其進行感官評定，探討地木耳添加量對酸乳品質(zhì)影響。

1.3.5 地木耳提取物添加量對牛乳發(fā)酵的影響

將地木耳水提物按0%、5%、10%、15%、20%、25%不同添加量加入滅菌后的鮮乳中，發(fā)酵之后4h后開始觀察凝乳情況，完全凝乳后，取出測定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對其進行感官評定，再放入4℃冰箱后熟發(fā)酵24h，取出測定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對其進行感官評定，探討地木耳添加量對牛乳發(fā)酵的影響。

1.3.6 酸度檢測方法

取成品酸奶1mL用蒸餾水稀釋10倍，并搖勻，滴加兩滴酚酞試劑，用0.09523mol/L NaOH溶液滴定，當溶液由無色變?yōu)榉奂t色且30s不褪去即為滴定終點，記錄消耗NaOH體積，樣品的滴定酸度由如下公式計算：

式中：C 為標準氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V 為滴定消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量或體積，g 或mL；0.1 為理論氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L；100 為稀釋倍數(shù)。

1.3.7 乳酸菌計數(shù)方法

（1）甲苯胺藍特殊染色法[4-5]

在自制計數(shù)板滴加0.01mL樣品稀釋液，用接種針小心涂滿1cm2的方孔使其均勻。晾干后在酒精燈上加熱固定數(shù)秒。滴加0.2%的甲苯胺藍染色液于上述樣品上，在酒精燈上稍加熱后移開，在室溫下染色2min后水洗晾干。然后用1%的乙酸進行脫色1s～2s即用水沖洗去乙酸，用濾紙吸干液體后鏡檢（鏡檢時選用油鏡，選取30個視野），乳酸菌數(shù)按下式計算：

乳酸菌總數(shù)（CFU/mL）=每個視野中的乳酸菌平均數(shù)×106×樣液稀釋倍數(shù)

（2）平板涂布計數(shù)法（國標法）[6]

根據(jù)GB4789.35-2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，選擇2 個適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1mL 樣品于2 個MRS培養(yǎng)基平板，用L形涂布棒將菌液涂布均勻，培養(yǎng)48h后計數(shù)。平板上菌落數(shù)以無蔓延菌落，每皿菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間為宜。若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按下列公式進行計算：

式中：N 為樣品中菌落數(shù)，CFU/mL；ΣC 為平板菌落數(shù)之和；n1 為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2 為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d 為稀釋因子。

1.3.8 酸奶感官評定方法

對酸奶從顏色、體態(tài)、氣味和滋味4個方面進行評定，滿分為10分，6位評判員對其進行品評打分，取平均分。酸奶感官評分（滿分10分）標準見表1。

1.3.9 地木耳酸奶理化及微生物指標測定方法

表1 酸奶感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of yoghourt

測定物標衛(wèi)生標準1HAIS2shen產(chǎn)品的理化指標及微生物指標按照GB19302-2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》中標準進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 地木耳提取物添加量對酸乳品質(zhì)的影響

酸乳凝乳后加入不同添加量地木耳提取物，對酸乳品質(zhì)影響結(jié)果見表2。

表2 地木耳添加量對酸乳品質(zhì)影響Table 2 Effects ofNostoc commune addition on the quality of yoghurt

從表2可知，凝乳后，添加地木耳水提物樣品在酸度和菌數(shù)方面均比對照要高，由此可見地木耳提取物對乳酸菌的生長有促進作用。而且都隨添加量的增加而增加，之后再減少，添加地木耳提取物5%、10%樣品的酸度和菌數(shù)均比對照高出許多，可能地木耳富含多糖，其中多糖促進了乳酸菌的生長，促進了發(fā)酵過程，縮短了發(fā)酵；添加地木耳提取物15%、20%、25%樣品酸度和菌數(shù)依次減少，可能是添加地木耳提取物體積過大，反而對培養(yǎng)體系進行了稀釋的緣故。

從乳酸菌數(shù)測定結(jié)果來看，甲苯胺藍染色法的數(shù)值總是高于國標法，主要由于國標法測定的是活菌數(shù)，而甲苯胺藍染色法測定的是總菌數(shù)。

從感官評分看，地木耳提取物添加量5%的酸乳風味最好，10%、15%次之，20%、25%最差，總體而言，酸乳風味的好壞與酸度的高低有很大關系，酸度達到一定值，酸度越高風味越差，沒達到最佳值，隨著酸度增加，風味越來越好。

2.2 地木耳提取物添加量對牛乳發(fā)酵的影響

在鮮乳中加入不同添加量的地木耳提取物，進行乳酸菌發(fā)酵，不同發(fā)酵時間地木耳添加量對牛乳發(fā)酵的影響結(jié)果分別見表3、表4。

表3 地木耳添加量對牛乳發(fā)酵的影響(4h)Table 3 Effects ofNostoc commune addition on the fermentation of milk (4h)

表4 地木耳添加量對牛乳發(fā)酵的影響(24h)Table 4 Effects ofNostoc commune addition on the fermentation of milk (24h)

由表3可知，加入地木耳水提物和牛乳、乳酸菌同時發(fā)酵，凝乳時間縮短，發(fā)酵4h后，酸度和乳酸菌的活菌都得到了很大提高。證明適當添加量的地木耳水提物對乳酸菌的繁殖也有明顯的促進作用。

由表4可知，加入地木耳水提物和牛乳、乳酸菌同時發(fā)酵，后熟24h樣品在酸度、菌數(shù)、感官評定方面的規(guī)律性同酸乳凝乳后加入地木耳與乳酸菌的發(fā)酵實驗結(jié)果相似。

總之，對乳酸菌的生長繁殖的影響方面，在接菌種時加地木耳水提物比凝乳后再加地木耳水提物，發(fā)酵酸度、菌數(shù)增加快一些，可能是在接菌種時加地木耳水提物，地木耳提供了乳酸菌生長繁殖所需的合適營養(yǎng)，加速了乳酸菌的生長繁殖；對產(chǎn)品顏色的影響方面，凝乳后再添加地木耳水提物，產(chǎn)品呈明顯的淺褐色，而且隨著水提物添加量的增加，顏色越深，說明地木耳提取物里面的營養(yǎng)物質(zhì)沒有被乳酸菌充分利用，而在接菌種時加地木耳水提物的所有樣品，顏色都同對照一樣呈均勻天然的乳白色；對產(chǎn)品風味的影響方面，接菌種時加地木耳水提物比凝乳后再加地木耳水提物，產(chǎn)品的風味更獨特，產(chǎn)品還會呈現(xiàn)出特殊香味。因此，在接菌種時加地木耳水提物可縮短酸奶的發(fā)酵時間，節(jié)約成本，產(chǎn)品呈均一的乳白色，風味獨特，香氣宜人。

2.3 地木耳酸奶品質(zhì)分析

地木耳酸奶產(chǎn)品的理化指標見表5、表6。

表5 地木耳酸奶的理化指標Table 5 Physical and chemical indexes ofNostoc commune-yogurt

表6 地木耳酸奶的微生物指標Table 6 Microbial indexes ofNostoc commune-yogurt

由表5、表6可知，地木耳酸奶產(chǎn)品質(zhì)量符合國標GB19302—2010《發(fā)酵乳》中風味乳指標要求。

3 結(jié)論

地木耳水提物對乳酸菌的生長繁殖有很大的促進作用，能縮短酸奶的后熟時間，而且能夠產(chǎn)生特殊的香味物質(zhì)，對酸奶的感官顏色沒有產(chǎn)生不良影響。因此地木耳酸奶生產(chǎn)的最佳條件是：在原料乳中，加地木耳水提物10%，乳酸菌接種量10%，40℃發(fā)酵4h，后熟12h。

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