張 晨，霍 倩，李翠珍，周志俊，吳 慶

甲狀腺癌是一種最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最普遍的甲狀腺腫瘤組織類型，占甲狀腺癌的59.9%～89.0%，其病因機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率高[1]。促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因的表達(dá)在甲狀腺癌中起著重要的作用[2]。促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)通過(guò)與TSHR結(jié)合發(fā)揮作用，激活2條主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：腺苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶途徑和磷脂酶c-蛋白激酶c通路。甲狀腺細(xì)胞表面表達(dá)的TSHR與TSH結(jié)合，可以上調(diào)鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/I-symporter，NIS)的表達(dá)[3]，發(fā)揮對(duì)碘代謝功能的調(diào)節(jié)作用。如果甲狀腺中TSHR表達(dá)缺失或功能異常，就會(huì)造成甲狀腺攝取、濃縮和利用碘的功能異常[4-5]。而TSHR基因的高甲基化會(huì)影響其基因的表達(dá)，并在甲狀腺乳頭狀腫瘤的形成與預(yù)后中起重要作用[6]。目前對(duì)于表觀遺傳在甲狀腺腫瘤中的作用研究較少，本研究利用Meta分析方法研究TSHR基因的甲基化與甲狀腺乳頭狀癌之間的關(guān)系，為預(yù)防和診治甲狀腺乳頭狀癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略 本研究以檢索詞(DNA OR TSHR OR thyroid stimulating hormone receptor)AND (thyroid OR papillary thyroid) AND (carcinoma OR cancer OR neoplasm OR tumor) AND (methylation OR epigenetic)計(jì)算機(jī)檢索Medline、Web of science、Cochrane Central、Ovid英文數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時(shí)以“甲狀腺乳頭狀癌”或“甲狀腺乳頭狀腫瘤”和“TSHR”為檢索詞計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方、維普數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時(shí)輔以文獻(xiàn)追溯和手工檢索等，收集各種雜志公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、學(xué)位論文和會(huì)議摘要等。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 兩名獨(dú)立檢索人員根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)篩選和納入文獻(xiàn)：(1)文獻(xiàn)研究方法均為流行病學(xué)研究，并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系。(2)TSHR基因甲基化的檢測(cè)方法為甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation specific PCR，MSP)、實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative methylation specific PCR，QMSP)或聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)。(3)所有納入文獻(xiàn)均有全文可供數(shù)據(jù)提取。(4)在每個(gè)研究中均有病例與對(duì)照。(5)如果是相同的病例人群在不同雜志發(fā)表，只納入其中最新或最完整的報(bào)道，避免提取重復(fù)數(shù)據(jù)。(6)每個(gè)研究的病例與對(duì)照人數(shù)均不少于3人。以下類型的研究被排除在外：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，案例報(bào)告，回顧薈萃分析，重復(fù)論文，綜述以及數(shù)據(jù)不足。相應(yīng)的文獻(xiàn)被進(jìn)一步檢索來(lái)確認(rèn)是否符合納入標(biāo)準(zhǔn)，檢索不一致的地方通過(guò)兩位檢索人員討論并解決。

1.3 數(shù)據(jù)收集與質(zhì)量評(píng)價(jià)方法 檢索收集信息包括第一作者的名稱，出版的時(shí)間，研究的樣本來(lái)源、大小，甲狀腺乳頭狀癌和正常或?qū)φ战M織中的TSHR基因甲基化水平，年齡分布，腫瘤分級(jí)，以及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對(duì)于對(duì)照選擇有三種定義：(1)正常的健康人群；(2)患有甲狀腺疾病但未患有甲狀腺惡性腫瘤的患者；(3)甲狀腺乳頭狀癌患者的癌旁組織。根據(jù)紐卡斯卡-渥太華質(zhì)量評(píng)價(jià)量表(Newcastle-Ottawa scale，NOS)評(píng)價(jià)納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)，選擇其中病例-對(duì)照研究量表，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括研究對(duì)象選擇、可比性和暴露3個(gè)方面，共9分。同時(shí)基于Meta分析的結(jié)果，應(yīng)用推薦分級(jí)的評(píng)價(jià)、制定與評(píng)估(grades of recommendations assessment，development and evaluation，GRADE)系統(tǒng)推薦分級(jí)方法[7]和GRADE profiler (version 3.6)軟件評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)的總體質(zhì)量及推薦等級(jí)，分級(jí)為：(1)高質(zhì)量：我們非常確信真實(shí)的效應(yīng)值接近效應(yīng)估計(jì)值；(2)中等質(zhì)量：我們對(duì)效應(yīng)估計(jì)值有中等程度的信心：真實(shí)值有可能接近估計(jì)值，但仍存在二者大不相同的可能性；(3)低質(zhì)量：我們對(duì)效應(yīng)估計(jì)值的確信程度有限：真實(shí)值可能與估計(jì)值大不相符；(4)極低質(zhì)量：我們對(duì)效應(yīng)估計(jì)值幾乎沒(méi)有信心：真實(shí)值很可能與估計(jì)值大不相同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用STATA軟件(Stata/SE 11.0 for Windows，StataCorp LP)用于統(tǒng)計(jì)分析。使用異質(zhì)性檢驗(yàn)，如果其研究間I2>50%，以及χ2檢驗(yàn)(P≤0.05)都認(rèn)為納入的研究存在異質(zhì)性，運(yùn)用 DerSimonian-Laird 隨機(jī)效應(yīng)模型[8]進(jìn)行數(shù)據(jù)合并；反之則認(rèn)為不存在異質(zhì)性，運(yùn)用Mantel-Haenszel固定效應(yīng)模型[8]進(jìn)行數(shù)據(jù)合并，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用合并OR值和95%CI表示，并計(jì)算不同研究間變異。τ2值表示有多大的異質(zhì)性是可以被亞組之間的差異所解釋[9]。Meta回歸分析用于解釋異質(zhì)性的來(lái)源。病例組和對(duì)照組中TSHR基因甲基化水平的OR通過(guò)分成不同亞組進(jìn)行分析，包括人群來(lái)源(中國(guó)和國(guó)外)、對(duì)照類型(自體組織和其他人群組織)、年齡分層(<45歲和≥45歲)、腫瘤TNM分期(早期和中晚期)以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。敏感度分析用于評(píng)價(jià)每個(gè)研究在最終結(jié)果中的貢獻(xiàn)度，漏斗圖以及Egger檢驗(yàn)分析其發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 使用文獻(xiàn)檢索詞，共檢索到214篇相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)一步通過(guò)納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，總共13篇文獻(xiàn)被挑選出來(lái)，通過(guò)閱讀分析全文，5篇文獻(xiàn)予以排除(見圖1)。剩余8篇文章[2，4，5，10-14]被合并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系(見表1)，得到的總樣本量為583份，其中甲狀腺癌組織樣本為342份，對(duì)照組樣本為241份；來(lái)自中國(guó)的研究為4篇，美國(guó)2篇，伊朗1篇，德國(guó)1篇；甲基化檢測(cè)方法主要有MSP、QMSP和COBRA。在隨機(jī)效應(yīng)模型中，甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因發(fā)生甲基化數(shù)與對(duì)照組相比的合并OR值為4.57〔95%CI(1.68，12.43)，z=2.98，P<0.01，見圖2〕。本研究GRADE系統(tǒng)評(píng)價(jià)推薦分級(jí)為中等質(zhì)量，推薦強(qiáng)度為中級(jí)。

表1 研究的基本情況

注：M+：樣本中甲基化數(shù)量，M-：樣本中未甲基化數(shù)量；A：同源對(duì)照(autologous control)，對(duì)照樣本來(lái)源患者自體癌旁組織；H：異質(zhì)對(duì)照(heterogeneous control)，對(duì)照樣本來(lái)源其他人群正常組織；MSP：甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)；QMSP：實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)；COBRA：聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法；NOS：紐卡斯卡-渥太華質(zhì)量評(píng)價(jià)量表(Newcastle-Ottawa scale)

圖1 文獻(xiàn)納入流程圖

圖2 納入研究的森林圖

2.2 分層分析和Meta回歸 表2展示了用不同分層進(jìn)行Meta分析的結(jié)果。在不同對(duì)照類型的分層分析中，對(duì)照為其他人群組織〔OR=8.51，95%CI(3.72，19.46)〕的甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因甲基化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于自體對(duì)照樣本〔OR=3.09，95%CI(0.67，14.27)〕。通過(guò)人群來(lái)源分層時(shí)，中國(guó)人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕甲狀腺乳頭狀癌中甲基化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于國(guó)外〔OR=1.99，95%CI(0.30，13.16)〕。在年齡分層分析中發(fā)現(xiàn)，年齡<45歲的人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕相比年齡≥45歲的人群〔OR=1.11，95%CI(0.17，7.20)〕，其TSHR基因甲基化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。在TNM不同分期時(shí)對(duì)甲基化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，TNM Ⅰ～Ⅱ期為甲狀腺乳頭狀癌早期階段，Ⅲ～Ⅳ期為中晚期階段，TSHR基因甲基化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)在中晚期階段〔OR=14.12，95%CI(2.93，68.18)〕明顯高于早期〔OR=6.01，95%CI(3.21，11.28)〕。對(duì)是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌樣本〔OR=14.29，95%CI(2.47，82.75)〕甲基化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于未觀察到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本〔OR=5.85，95%CI(3.15，10.85)〕。

由于本研究存在異質(zhì)性(I2=72.7%，χ2=25.65，P<0.01)，因此進(jìn)行Meta回歸分析(Knapp-Hartung修正)，研究間的殘差用τ2來(lái)表示，使用限制性最大似然比法來(lái)估計(jì)研究間的變異程度。Meta回歸分析的結(jié)果表明，樣本量的差異與異質(zhì)性呈負(fù)相關(guān)(Coefficient=0.04，P<0.05，AdjustedR2=66.78%，見表3)，而其他因素諸如：男性比例、年齡、出版年份、對(duì)照類型、人群來(lái)源均與研究的異質(zhì)性無(wú)關(guān)。

2.3 敏感性分析與發(fā)表偏倚 敏感性分析表明有一項(xiàng)研究[5]可能是異質(zhì)性的主要來(lái)源(見表4)，當(dāng)把這項(xiàng)研究移除后，在甲狀腺乳頭狀癌人群中TSHR基因甲基化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與對(duì)照相比異質(zhì)性明顯降低(χ2=8.91，P=0.179,I2=32.7%)。除此之外，并沒(méi)有其他單項(xiàng)研究能夠影響合并后的OR值。通過(guò)繪制漏斗圖，研究大致呈對(duì)稱漏斗分布(見圖3)，同時(shí)Egger檢驗(yàn)(t=-0.01，P>0.05)也表明此次納入對(duì)象不存在發(fā)表偏倚，納入的文章質(zhì)量良好。

表2 促甲狀腺激素受體基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

表3 Meta回歸分析

表4 異質(zhì)性分析

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌最為常見，其發(fā)病率較高，其發(fā)生、發(fā)展是包括癌基因的激活和抑癌基因失活等多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，目前普遍認(rèn)為DNA的甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要機(jī)制[15-16]。TSHR是甲狀腺細(xì)胞的一種特異性蛋白質(zhì)，主要分布于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞膜上，其主要功能是與TSH結(jié)合，通過(guò)刺激甲狀腺聚集碘全面調(diào)節(jié)甲狀腺功能。然而，對(duì)于TSHR基因的甲基化在人甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前尚未統(tǒng)一[6，17]，TSHR表達(dá)異常以及其甲基化發(fā)生率的提高與許多甲狀腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系仍在探索中[3，18]。因此本研究通過(guò)Meta分析對(duì)TSHR基因的甲基化與人甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)綜合的評(píng)價(jià)。

圖3 發(fā)表偏倚的漏斗圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TSHR基因甲基化狀態(tài)與人甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生之間的風(fēng)險(xiǎn)，本研究綜合了342份病例以及241份對(duì)照進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因的甲基化明顯高于對(duì)照組，是可能的危險(xiǎn)因素。分層分析中，TSHR基因的甲基化在中國(guó)人群中以及年齡<45歲的人群中也是潛在的甲狀腺乳頭狀癌危險(xiǎn)信號(hào)，其甲基化發(fā)生頻率是對(duì)照組的9.18倍，并且在Meta回歸中，年齡的回歸系數(shù)為-0.13，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。以往研究也表明，甲狀腺癌發(fā)病高危人群為青壯年，平均年齡為40歲，之后發(fā)病率有所下降[19-20]，但在中老年人群中甲狀腺癌的預(yù)后很差[21-22]。這與本研究結(jié)果較符，因此TSHR基因甲基化也許能夠作為一個(gè)獨(dú)立的分子標(biāo)志物對(duì)中國(guó)特定年齡人群的甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)行篩查。

TSHR基因的甲基化發(fā)生率與人甲狀腺乳頭狀癌的TNM臨床分期，以及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都有密切聯(lián)系[2，10]，但其研究結(jié)果卻存在爭(zhēng)議[14，23]。通過(guò)Meta分析表明，TSHR基因甲基化的發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌早期已經(jīng)存在，并貫穿于整個(gè)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展過(guò)程中。在甲狀腺乳頭狀癌的中晚期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的人群中，其TSHR基因甲基化風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，與其早期階段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究表明TSHR基因甲基化不僅在甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中具有重要意義，而且對(duì)甲狀腺乳頭狀癌中晚期不良預(yù)后以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有指示作用。

還需要指出的是，本次研究仍然存在著一些局限性，首先研究所納入的8篇中英文文獻(xiàn)均為病例對(duì)照研究，并且樣本量較小，這與甲基化水平檢測(cè)的技術(shù)要求以及研究費(fèi)用較高有關(guān)。其次一些影響因素，如生活方式、性別、遺傳因素并未納入研究中予以分析，這為以后研究提供了方向。

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