楊香山，程紹梅，郭京艷，李成軍，李愛(ài)萍，韓 琳

近年來(lái)，甲狀腺乳頭狀微小癌的發(fā)病率逐漸增高且發(fā)病機(jī)制及術(shù)式選擇日漸受到關(guān)注。甲狀腺乳頭狀微小癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如環(huán)境因素、癌基因等。接合物蛋白(CRKL)作為CRK(CT10 regulator of kinase)家族的成員之一，通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)構(gòu)域與多種信號(hào)分子結(jié)合形成復(fù)合物，將信號(hào)傳遞給下游，通過(guò)多條信號(hào)途徑參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[1]。然而，CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，本研究采用免疫組織化學(xué)(SP)技術(shù)檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中CRKL的表達(dá)，通過(guò)對(duì)比CRKL的表達(dá)差異，探討CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌中的臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院2008—2013年經(jīng)手術(shù)治療的50例直徑>1 cm的甲狀腺乳頭狀癌患者、50例甲狀腺乳頭狀微小癌患者、50例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者、50例正常者甲狀腺組織的石蠟標(biāo)本。甲狀腺乳頭狀癌組：男13例，女37例；年齡16～76歲，中位年齡44歲，其中≤45歲31例，>45歲19例；有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；均行手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)；術(shù)前均無(wú)化療、放療及免疫治療史。甲狀腺乳頭狀微小癌組：男6例，女44例，年齡22～68歲，中位年齡45歲，其中≤45歲22例，>45歲28例；有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例(伴甲狀腺被膜浸潤(rùn)8例)，無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例(均無(wú)甲狀腺被膜浸潤(rùn))；均行手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)；術(shù)前均未行其他治療。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組：男15例，女35例，年齡19～68歲，中位年齡42歲；單發(fā)20例，多發(fā)30例；均行手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前均未合并其他疾病。正常甲狀腺組織組：男9例，女41例；年齡21～66歲，中位年齡42歲；均隨機(jī)選自甲狀腺乳頭狀癌以及甲狀腺乳頭狀微小癌患者的癌旁正常組織，均經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科兩名醫(yī)生確診為正常組織；術(shù)前均未合并其他疾病。

1.2主要試劑小鼠抗人CRKL單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、多聚物輔助試劑與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3SP染色方法以Santa Cruz公司提供的CRKL表達(dá)陽(yáng)性的切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽(PBS)緩沖液作為陰性對(duì)照。石蠟標(biāo)本常規(guī)切片、脫蠟、水化、過(guò)氧化氫(H2O2)去除組織過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)15 min；PBS沖洗5 min/次，共3次，加入山羊血清封閉20 min，加入小鼠抗人CRKL 4 ℃過(guò)夜；PBS沖洗，加入多聚物輔助試劑孵育15 min；PBS沖洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗孵育20 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。陽(yáng)性表達(dá)時(shí)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色片狀或顆粒狀，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每張切片選取5個(gè)不同的視野，采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)算CRKL表達(dá)平均吸光度(MOD)。

1.4Western blotting實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法提取組織總蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入50 μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉后加入CRKL兔抗人抗體(1∶500)，4 ℃過(guò)夜。TBST溶液洗膜，GAPDH作為內(nèi)參，加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。Quantity one分析蛋白條帶灰度值。以目的條帶灰度值與對(duì)應(yīng)的GAPDH灰度值之比作為蛋白水平的定量指標(biāo)。

2　結(jié)果

2.1CRKL在不同甲狀腺組織中的表達(dá)情況CRKL在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌細(xì)胞的胞膜與胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，呈淺黃色-棕褐色細(xì)顆粒狀(見(jiàn)圖1、2)；CRKL在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的部分細(xì)胞中表達(dá)，呈淺黃色-棕褐色細(xì)顆粒狀(見(jiàn)圖3)；正常甲狀腺組織細(xì)胞幾乎未見(jiàn)染色(見(jiàn)圖4)。

甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組及正常甲狀腺組織組中CRKL的表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組中CRKL表達(dá)的MOD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2CRKL表達(dá)量與甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌臨床病理特征的關(guān)系CRKL表達(dá)量與甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌患者年齡、性別、病灶數(shù)目均無(wú)關(guān)(P>0.05)；與有無(wú)侵犯被膜、有無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表1　不同甲狀腺組織中CRKL表達(dá)陽(yáng)性率及表達(dá)量比較

注：▲為F值；與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組比較，*P<0.05；與正常甲狀腺組織組比較，△P<0.05；MOD=平均吸光度

Table2Correlation between expression of CRKL and clinical pathological data of patients with thyroid papillary or carcinoma thyroid papillary micro-carcinoma

甲狀腺乳頭狀癌例數(shù)　　MOD　　　t值　P值甲狀腺乳頭狀微小癌例數(shù)　　MOD　　　t值　P值性別1 52>0 051 89>0 05　男130 498±0 22160 501±0 281　女370 558±0 230440 543±0 221年齡(歲)0 89>0 051 68>0 05　<45310 523±0 192220 512±0 169　≥45190 562±0 215280 551±0 102病灶數(shù)目1 63>0 051 96>0 05　單發(fā)320 576±0 246240 533±0 157　多發(fā)180 521±0 198260 519±0 235侵犯被膜6 09<0 015 68<0 01　有110 679±0 12180 702±0 092　無(wú)390 495±0 104420 486±0 152頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8 12<0 017 53<0 01　有360 739±0 118270 764±0 085　無(wú)140 286±0 098230 325±0 134

圖1CRKL在甲狀腺乳頭狀癌陽(yáng)性表達(dá) (SP，×200)

圖2CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌陽(yáng)性表達(dá) (SP，×200)

圖3CRKL在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫陽(yáng)性表達(dá) (SP，×200)

圖4CRKL在癌旁正常組織陰性表達(dá) (SP，×200)

Figure1Positive expression of CRKL in thyroid papillary carcinoma

Figure2Positive expression of CRKL in thyroid papillary micro-carcinoma

Figure3Positive expression of CRKL in nodular goiter

Figure4Negative expression of CRKL in normal tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma

2.3Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRKL在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺乳頭狀微小癌組織的表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌組與甲狀腺乳頭狀微小癌組CRKL含量均高于正常甲狀腺組織組；甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌轉(zhuǎn)移組的CRKL含量均高于未轉(zhuǎn)移組(見(jiàn)圖5、6)。

圖5CRKL在正常甲狀腺組織及甲狀腺乳頭狀癌未轉(zhuǎn)移組、轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況

Figure5Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

圖6CRKL在正常甲狀腺組織及甲狀腺乳頭狀微小癌未轉(zhuǎn)移組、轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況

Figure6Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary micro-carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

3　討論

甲狀腺乳頭狀癌是頭頸部最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，盡管生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，但極易發(fā)生早期頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，部分患者在晚期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如轉(zhuǎn)移到肺、骨和腦等，嚴(yán)重影響患者的生存。甲狀腺乳頭狀微小癌是甲狀腺乳頭狀癌的一種亞型，直徑在1 cm以下，但仍具有腺內(nèi)與腺外侵襲性及頸部淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性。

本研究結(jié)果顯示，直徑>1 cm的甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺乳頭狀微小癌組織中CRKL表達(dá)的MOD高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織。已有研究表明，CRKL在乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈過(guò)度表達(dá)[2-5]，且與患者預(yù)后、腫瘤惡化緊密相關(guān),本研究與此相符。

CRKL是CRK家族成員之一，是整合素介導(dǎo)的信號(hào)途徑的下游分子之一，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)呈串聯(lián)排列的SH3結(jié)構(gòu)域。CRKL中SH2結(jié)構(gòu)域與上游酪氨酸磷酸化的Cas、CasL、HEFl、BCR/Cbl等信號(hào)分子結(jié)合，而N端的SH3結(jié)構(gòu)域與下游富含脯氨酸的Dockl80、C3G、Sos、ABL和P13K等信號(hào)分子結(jié)合形成“黏著斑”復(fù)合物[5-7]，從而將信號(hào)通過(guò)Dockl 80傳遞給Racl，刺激細(xì)胞層狀邊緣和細(xì)胞膜波動(dòng)緣的形成，可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖及分化[8]。去磷酸化的CRKL可激活C3G[9]，C3G促進(jìn)Rapl與GDP分離，使其與GTP結(jié)合，從而使Rapl無(wú)活性的GDP結(jié)合形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腉TP結(jié)合形式，再通過(guò)MAPK途徑亦可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖及分化。CRKL蛋白可能通過(guò)整合信號(hào)通路增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和浸潤(rùn)，促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、分化、遷移，進(jìn)而影響甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展。由此推測(cè)可以通過(guò)拮抗或沉默CRKL蛋白的表達(dá)及阻斷其信號(hào)通路中的蛋白分子來(lái)阻止甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌和甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)無(wú)差異，但CRKL表達(dá)與甲狀腺乳頭狀微小癌和甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯被膜均有關(guān)系，提示二者可能具有相同的生物學(xué)特性。甲狀腺乳頭狀癌早期經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌的手術(shù)方式，國(guó)外學(xué)者建議應(yīng)行預(yù)防性頸淋巴結(jié)清掃術(shù)[10]。由于甲狀腺乳頭狀微小癌也經(jīng)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，故在治療方面二者可以采用相同的手術(shù)方式，對(duì)甲狀腺乳頭狀微小癌也應(yīng)行頸部淋巴結(jié)清掃。

總之，CRKL的表達(dá)可以作為潛在的靶點(diǎn)用于甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌等的治療[11]；另外，CRKL與甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、被膜侵犯密切相關(guān)，更為臨床頸淋巴結(jié)清掃奠定了理論基礎(chǔ)。

1翟波，廖侃.接頭蛋白c-Crk的結(jié)構(gòu)和功能[J].生命的化學(xué)，2003，23(3)：198-201.

2Fathers KE,Rodrigues S,Zuo D,et al.CrkⅡ transgene induces atypical mammary gland development and tumorigenesis[J].Am J Pathol,2010,176(1):446-460.

3沈太敏，趙純?nèi)w涌，等.接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008，11(6)：940-942.

4Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

5Jano?tiak R,Tolde O,Bruhová Z,et al.Tyrosine phosphorylation within the SH3 domain regulates CAS subcellular localization,cell migration,and invasiveness[J].Mol Biol Cell,2011,22(22):4256-4267.

6Zheng J,Machida K,Antoku S,et al.Proteins that bind the Src homology 3 domain of CrkⅠ have distinct roles in Crk transformation[J].Oncogene,2010,29(48):6378-6389.

7Watanabe T,Tsuda M,Tanaka S,et al.Adaptor protein Crk induces Src-dependent activation of p38 MAPK in regulation of synovial sarcoma cell proliferation[J].Mol Cancer Res,2009,7(9):1582-1592.

8Wang H,Linghu H,Wang J,et al.The role of Crk/Dock180/Rac1 pathway in the malignant behavior of human ovarian cancer cell SKOV3[J].Tumour Biol,2010,31(1):59-67.

9Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

10Chisholm EJ,Kulinskaya E,Tolley NS.Systematic review and meta-analysis of the adverse effects of thyroidectomy combined with central neck dissection as compared with thyroidectomy alone[J].Laryngoscope,2009,119(6):1135-1139.

11Natsume H,Shinmura K,Tao H,et al.The CRKL gene encoding an adaptor protein is amplified,overexpressed,and a possible therapeutic target in gastric cancer[J].J Transl Med,2012(10):97.