周佰林 張琦 張紅征 李煥斌 文正偉 王玲

人鈉/碘轉(zhuǎn)運體基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞及相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測

周佰林 張琦 張紅征 李煥斌 文正偉 王玲

目的以重組人鈉/碘轉(zhuǎn)運體（hNIS）基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞并檢測hNIS mRNA及蛋白的表達(dá)，為放射性碘治療非甲狀腺腫瘤提供新思路。方法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）進(jìn)行酶切、測序鑒定并擴(kuò)增、提取。SW480細(xì)胞分為重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒（pcDNA3.1+）轉(zhuǎn)染組、空白對照組，轉(zhuǎn)染后以RT-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞hNIS mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果酶切和測序結(jié)果顯示插入的hNIS基因大小和方向均正確。RT-PCR和Western blot顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞可見hNIS mRNA和蛋白的表達(dá)，而空白對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均未檢測到hNIS mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論脂質(zhì)體法可有效地將hNIS基因轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞并成功表達(dá)hNIS蛋白。

鈉/碘轉(zhuǎn)運體 蛋白免疫印跡 基因轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體

【 Abstract】 ObjectiveTo transfect human sodium/iodide symporter gene hNIS into colon cancer SW480 cells and to examine the hNIS mRNA and protein expression.MethodsThe recombinant plasmid(pcDNA3.1+-hNIS)was constructed,identified and transfected into SW480 cells with lipofectamine 2000.Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot were applied to detect the hNIS mRNA and protein expression.ResultsEnzyme digestion and DNA sequencing confirmed the size and direction of the recombinant(pcDNA3.1+-hNIS)plasmid.RT-PCR and Western blot showed the expression of hNIS mRNA and protein in pcDNA3.1+-hNIS-transfected SW480 cells,not in non-transfected cells or blank plasmid-transfected cells.ConclusionThe hNIS gene is effectively transfected into human colon cancer SW480 cells and the NIS protein is expressed successfully.

鈉/碘轉(zhuǎn)運體（sodium/iodide symporter，NIS）是甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜外側(cè)的一個鑲嵌蛋白，也是甲狀腺激素生物合成、核素顯像及放射性碘治療的基礎(chǔ)。131Ⅰ為放射性核素，其衰變過程中可發(fā)射β射線從而起到抑制、殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞的作用，NIS則具有濃聚131Ⅰ的功能。由于一些甲狀腺癌喪失聚碘功能以及一些非甲狀腺腫瘤無聚碘功能，使放射性碘治療難以發(fā)揮作用。本研究利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染hNIS基因到結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，并通過RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)hNIS mRNA和蛋白的表達(dá)，以期為放射性碘治療非甲狀腺腫瘤提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞由溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科惠贈，質(zhì)粒pcDNA3.1+由復(fù)旦大學(xué)惠贈，pcDNA3.1+-hNIS重組質(zhì)粒由本實驗室合成，BamH I/ EcoR I、MiniBEST Plasmid Purification Kit購自大連寶生物公司，LipofectamineTM2000購自invitrogen公司，hNIS蛋白一抗購自Abcam公司，內(nèi)參β-actin一抗以及相關(guān)二抗購自Santa cruz公司，hNIS和β-actin上下游引物及測序引物等由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SW480細(xì)胞以1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，長滿培養(yǎng)瓶85%～90%時傳代。將細(xì)胞分為重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒（pcDNA3.1+）轉(zhuǎn)染組和空白對照組。

1.2.2 重組質(zhì)粒酶切和測序 取pcDNA3.1+-hNIS 5μl、10×緩沖液5μl、BamHⅠ1.5μl、EcoRⅠ1.5μl、以ddH2O加到總體積50 μl，37℃反應(yīng)2h，取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。測序由大連寶生物公司完成，測序完成后整合4次測序結(jié)果得出插入基因序列。

1.2.3 擴(kuò)增提取重組質(zhì)粒 （1）配置LB培養(yǎng)基100ml，加入瓊脂高溫高壓滅菌，搖勻；加入氨芐青霉素60μl（50mg/ml）混勻；將培養(yǎng)基倒入玻璃平板培養(yǎng)皿，凝固后倒置紫外殺菌30min；大腸桿菌接種到培養(yǎng)基上37℃過夜；第2天挑取單菌落接種到添加了氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基5ml玻璃試管中，37℃，200r/min搖床過夜培養(yǎng)。（2）采用傳統(tǒng)SDS堿裂解法提取高純度質(zhì)粒DNA并測定OD260和OD280。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞 制備DNA-LipofectamineTM2000混合物：將5μl脂質(zhì)體加入245μl無血清1640培養(yǎng)基；再將5μg重組質(zhì)粒加入245μl無血清培養(yǎng)基，室溫放置5min后，將稀釋的質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混勻室溫放置20min，形成DNA-LipofectamineTM2 000混合物。將其加入6孔板細(xì)胞中，培養(yǎng)6h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.5 RT-PCR檢測hNIS mRNA表達(dá) 異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總RNA，計算RNA含量和純度。hNIS上游引物：5′GACTGATGTGTTCCAGGTCGT3′，下游引物：5′GGGTCGCAGTCAGTGTAGAAC3′；內(nèi)參βactin上游引物：5′CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT3′，下游引物：5′GGAGCAATGATCTTGATCTT3′。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火（hNIS 59℃、βactin 72℃）30s，72℃延伸30s，31個循環(huán)再72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 Western blot檢測hNIS蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞后提取蛋白，上樣檢測，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，ECL法暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 酶切以及測序結(jié)果 對重組質(zhì)粒進(jìn)行BamH I/ EcoR I雙酶切，結(jié)果顯示在1 944bp和5 405bp左右有兩條清晰的條帶,與理論計算結(jié)果相符合，見圖1。測序結(jié)果顯示整個核苷酸序列包括起始密碼子ATG到終止密碼子TGA的643個氨基酸和NCBI序列CDS區(qū)序列相同（NM_000453），基因大小和方向也正確。

2.2 擴(kuò)增提取重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 以Beyotime DNA Ladder為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示在7 000bp左右有1條清晰條帶，可以證實本次質(zhì)粒提取成功，見圖2。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS BamH I/EcoR I雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖（M1:λ-Hind III酶切；1：pcDNA3.1+DNA；2：pcDNA3.1+-hNIS-BamH I/EcoR I；3：hNIS DNA；M2：DNA Marker）

圖2 重組質(zhì)粒提取瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 擴(kuò)增提取重組質(zhì)粒BamH I/EcoR I雙酶切檢測酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 944bp和5 405bp有兩條清晰的條帶與理論計算結(jié)果相符合，可以證實本次質(zhì)粒為pcDNA3.1+-hNIS，見圖3。

圖3 擴(kuò)增提取重組質(zhì)粒BamHI/EcoR I雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 RT-PCR檢測細(xì)胞hNIS mRNA表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增的369bp大小條帶，而在空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組均未檢測到hNIS mRNA的表達(dá)，見圖4。2.5 Western blot檢測細(xì)胞hNIS蛋白表達(dá) Western blot顯示在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞可見69KD大小條帶，而在空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組均未檢測到hNIS蛋白的表達(dá)，見圖5。

圖4 RT-PCR檢測細(xì)胞hNIS mRNA表達(dá)（1：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；2：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：空白對照組）

圖5 Western blot檢測細(xì)胞hNIS蛋白表達(dá)（1：空白對照組；2：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）

3 討論

近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，尤其是DNA重組和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)逐步成熟，基因治療腫瘤成國內(nèi)外研究熱門。利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入目的基因，改變細(xì)胞的生物學(xué)特性，或者將與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的變異基因加以校正或修復(fù)以治療腫瘤已有較多研究。

口服131Ⅰ治療分化型甲狀腺癌療效顯著[1-3]，因甲狀腺濾泡細(xì)胞表達(dá)NIS蛋白,介導(dǎo)病灶細(xì)胞中131Ⅰ逆濃度梯度的主動轉(zhuǎn)運，使病灶濃聚131Ⅰ，利用131Ⅰ的β射線發(fā)揮治療作用。Smanik[4]等從人甲狀腺cDNA文庫中分離出hNIS基因,利用其轉(zhuǎn)染非甲狀腺腫瘤細(xì)胞，使放射性核素治療成為可能。已有Smit等[5]和Shimura等[6]的研究說明hNIS轉(zhuǎn)基因技術(shù)在攝碘率低下的甲狀腺癌中進(jìn)行放射性碘治療的可行性。同時有更多的研究[7-8]將hNIS轉(zhuǎn)染非甲狀腺腫瘤細(xì)胞使其表達(dá)NIS蛋白，從而對放射性碘的攝取和貯存增加，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。許多學(xué)者[9-13]進(jìn)行了不同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)NIS基因介導(dǎo)細(xì)胞碘攝取的體內(nèi)外研究，Yan等[14]亦利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2 000為載體，成功將hNIS基因轉(zhuǎn)染至人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549。周泉波等[15]利用重組pDC316-MCMV/hNIS真核表達(dá)質(zhì)粒將hNIS基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-Ⅱ細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3細(xì)胞。以上研究為轉(zhuǎn)染hNIS到非甲狀腺腫瘤，實現(xiàn)放射性碘治療提供了有力的實驗證據(jù)。

本實驗中pcDNA3.1+-hNIS重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[16]，BamH I/EcoR I雙酶切結(jié)果顯示重組質(zhì)粒在1 944bp和5 405bp左右有兩清晰電泳條帶，與理論計算結(jié)果相符，證實重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS中成功插入了hNIS序列。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞可見hNIS mRNA和蛋白表達(dá)，而在空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組均未檢測到hNIS mRNA和蛋白的表達(dá)。本實驗結(jié)果說明轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞成功，可為下一步進(jìn)行放射性碘治療作初步準(zhǔn)備。

盡管NIS的研究已經(jīng)取得了長足進(jìn)步，但NIS的靶向作用、表達(dá)程度、在腫瘤細(xì)胞中的分布等一系列問題還要進(jìn)一步探索。目前轉(zhuǎn)染的載體是質(zhì)粒、病毒或非病毒載體,所使用的啟動子一般都是巨細(xì)胞病毒啟動子，啟動效率高，但特異性差，在所有細(xì)胞中都可以高效的表達(dá)外源基因。目前的研究表明碘在轉(zhuǎn)染NIS基因的非甲狀腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)滯留時間過短，可能與碘被攝取后未能進(jìn)一步實現(xiàn)有機(jī)化而迅速流失有關(guān)。如何提高放射性碘對腫瘤組織的靶向性，以及延長碘在細(xì)胞內(nèi)的滯留時間等方面還需要更深入的研究。

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Expression of human sodium/iodide symporter protein in hNIS-transfected colon cancer SW480 cells

Sodium/iodide symporterWestern blotGene transfection Liposome

2012-04-19）

（本文編輯：胥昀）

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20090094）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室

張琦，E-mail:wzzhangqi@126.com