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        PDGF對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞中ERK通路的影響研究

        2013-04-18 07:10:52盧虹蓓張維溪李昌崇
        浙江醫(yī)學 2013年22期
        關(guān)鍵詞:平滑肌氣道哮喘

        盧虹蓓 張維溪 李昌崇

        PDGF對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞中ERK通路的影響研究

        盧虹蓓 張維溪 李昌崇

        目的 研究血小板源性生長因子(PDGF)對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞(ASMC)中ERK信號通路的調(diào)控作用。 方法建立哮喘大鼠模型,原代分離培養(yǎng)ASMC,設(shè)未干預組(A組)、ERK阻斷劑組(B組)、PDGF組(C組)和PDGF+ERK阻斷劑組(D組)。A組不加干預;B組又分為B1、B2、B3、B4組,分別加入濃度為0.1、1、5、10μmol/L的ERK阻斷劑U0126;C組又分為C1、C2、C3、C4組,分別加入濃度為1、10、25、50μg/L的PDGF同二聚體PDGF-BB;D組加入10μmol/L的U0126和50μg/L的PDGF-BB。以RT-PCR法檢測各組ERK1和TGF-β1的mRNA表達,免疫組化法檢測A、B4、C4和D組中以上蛋白的表達。 結(jié)果 RT-PCR提示B1、B2、B3、B4組ERK1 mRNA表達均顯著低于A組(均P<0.01),U0126以濃度依賴的方式抑制PDGF誘導的ASMC中ERK的活化,C1、C2、C3、C4組ERK1 mRNA表達均顯著高于A組(均P<0.01),ERK1 mRNA的表達與PDGF-BB存在明顯的濃度依賴關(guān)系,D組與A組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。免疫組化提示B4組ASMC中ERK1蛋白表達顯著低于A組,C4組顯著高于A組(均P<0.01),D組與A組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);B4組TGF-β1蛋白表達顯著低于A組,C4組顯著高于A組,同時C4組顯著高于B4組(均P<0.01),D組與A組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結(jié)論 PDGF可劑量依賴性激活哮喘大鼠ASMC內(nèi)的ERK通路,同時伴隨TGF-β1信號通路的活化。ERK通路參與了ASMC增殖的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程,PDGF可能經(jīng)ERK環(huán)節(jié)促進TGF-β1通路活化。

        哮喘 氣道平滑肌細胞 細胞外調(diào)節(jié)激酶 氣道重塑 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

        作為支氣管哮喘(簡稱哮喘)的特征性病理生理改變之一,氣道重塑(airway remodelling)的概念于1992年被明確提出。氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells,ASMC)增殖在氣道重塑中占有十分重要的地位,有報道顯示哮喘患者氣道平滑肌厚度是對照組的3倍[1]。本實驗以血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)刺激哮喘大鼠ASMC增殖,并以ERK特異性抑制劑U0126阻斷ERK通路后,觀察ERK1和TGF-β1 mRNA及其蛋白在ASMC內(nèi)的表達情況,探討ERK信號通路對哮喘氣道重塑的作用。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠24只,4~6周齡,體重120~160g,由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供,飼養(yǎng)于SPF級實驗動物飼養(yǎng)室。

        1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于法國Biowest公司,小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體、小鼠抗大鼠磷酸化ERK1(p-ERK1)單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司,小鼠抗大鼠α-actin單克隆抗體購于武漢博士德公司,重組大鼠PDGF-BB(PDGF的同二聚體之一)為美國R&D公司產(chǎn)品,U0126購于美國Cell Signal Technology公司,ERK1和GAPDH引物由上海生工公司合成,引物序列如下:ERK1上游:5′-GACTCCTACCTGAAGCATAC-3′,下游:5′-TCCTTGACACGCAGAATG-3′,產(chǎn)物203bp。TGF-β1上游:5′-GCAACAACGCAATCTATGAC-3′,下游:5′-CCCTGTATTCCGTCTCCTT-3′,產(chǎn)物 301bp。GAPDH上游:5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′,下游:5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′,產(chǎn)物140bp。

        1.3 哮喘大鼠模型的建立和ASMC的培養(yǎng)[2]

        1.3.1 哮喘大鼠模型建立 按隨機數(shù)字表法選取12只大鼠,依據(jù)既往報道方法建立哮喘大鼠模型[3-4]。致敏階段:第1天和第8天腹腔注射卵清白蛋白OVA/Al(OH)3混合液1.5ml[內(nèi)含OVA 1mg和Al(OH)3100mg]。激發(fā)階段:第15天開始以含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液霧化吸入,隔天一次,每次30min,共60d。另外12只大鼠為對照組,致敏和激發(fā)時均以0.9%氯化鈉代替OVA,其余與哮喘組相同。各組均于末次激發(fā)后2h處死大鼠,留取血清并立即開胸,右肺經(jīng)支氣管肺泡灌洗留取支氣管肺泡灌洗液(BALF),分離左肺組織用于病理切片、免疫組織化學檢測。

        1.3.2 哮喘大鼠ASMC的培養(yǎng)和鑒定 從12只哮喘大鼠中平均分離提取氣管、支氣管平滑肌組織,以膠原酶-胰酶混合消化法培養(yǎng)哮喘大鼠ASMC。細胞生長融合后,0.25%的胰蛋白酶消化,以107~108/L的密度傳代培養(yǎng)。光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)學并對細胞內(nèi)平滑肌肌動蛋白α-actin進行免疫組織化學染色。>95%的細胞著色呈陽性,證實為ASMC。取生長狀態(tài)良好的3~5代細胞用于實驗。

        1.4 ASMC的分組和藥物干預

        1.4.1 ASMC的分組 哮喘大鼠ASMC按是否加入藥物及藥物濃度的不同分為未干預組(A組),加入無血清DMEM 2ml;ERK阻斷劑組(B組),根據(jù)藥物干預濃度不同分為B1、B2、B3、B4四組,分別加入含U0126濃度為0.1、1、5、10μmol/L的DMEM 2ml;PDGF組(C組),根據(jù)藥物干預濃度不同分為C1、C2、C3、C4四組,分別加入含PDGF-BB濃度為1、10、25、50μg/L的DMEM 2ml;PDGF+ERK阻斷劑組(D組),加入含U0126和PDGFBB的濃度分別為10μmol/L和50μg/L的DMEM 2ml。

        1.4.2 ASMC的藥物干預 細胞按6×103/ml的密度接種于6孔板,待生長至接近融合時,吸出培養(yǎng)液,DHanks液洗細胞,加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,維持培養(yǎng)24h,使細胞同步化于G0期,加入不同濃度的U0126和PDGF-BB作用2h后,以無血清培養(yǎng)基洗滌細胞,以備進一步實驗。

        1.5 RT-PCR法測ASMC內(nèi)TGF-β1及ERK1的mRNA表達 提取總RNA,采用紫外分光光度法檢測RNA純度后行RT-PCR,用Smart View凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析PCR產(chǎn)物電泳條帶。目的mRNA的相對含量以目的條帶與GAPDH條帶吸光度比值表示。

        1.6 免疫組化SP法檢測ASMC內(nèi)ERK1蛋白及TGF-β1蛋白表達 從6孔板內(nèi)取出細胞爬片,免疫組化SP法染色,胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色沉淀為陽性結(jié)果。應(yīng)用imagepro plus圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度(MOD),用以代表陽性部位的蛋白表達水平。

        1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步以LSD-t檢驗進行兩兩比較。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠一般情況及病理改變 哮喘組大鼠在激發(fā)時均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀,嚴重者呼吸減慢或節(jié)律不齊,行動遲緩或俯伏不動,而對照組大鼠無上述表現(xiàn)。經(jīng)過多次激發(fā)后,哮喘組上述癥狀反而有所減輕,但體重增長減慢,毛色無光澤。光鏡示哮喘組黏膜下、支氣管及血管周圍大量炎癥細胞浸潤,氣道上皮黏液腺增生,支氣管壁明顯增厚、管腔狹窄,嗜酸粒細胞增多;電鏡下示哮喘組肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,膠原纖維增生,肺泡隔增寬,見圖1。

        圖1 哮喘組大鼠氣管及肺泡病理切片(A:光鏡觀察,HE染色,×200;B:光鏡觀察,HE染色,×400;C:電鏡觀察,×6 000)

        2.2 RT-PCR檢測ASMC中ERK1和TGF-β1 mRNA的表達 B1、B2、B3、B4組大鼠ASMC中ERK1 mRNA表達均顯著低于A組,且B組內(nèi)兩兩比較,均有統(tǒng)計學差異;C1、C2、C3、C4組大鼠ASMC中ERK1 mRNA表達均顯著高于A組,且C組內(nèi)兩兩比較,也均有統(tǒng)計學差異(均P<0.01),D組與A組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組間TGF-β1 mRNA表達比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05),見表1及圖2。

        表1 各組大鼠ASMC中ERK1和TGF-β1 mRNA的表達

        圖2 RT-PCR檢測ASMC中ERK1和TGF-β1 mRNA的表達(A:ERK1;B:TGF-β1)

        2.3 免疫組化檢測ASMC內(nèi)ERK1和TGF-β1蛋白表達 大鼠ASMC中ERK1蛋白的表達B4組(0.18±0.05)顯著低于A組(0.31±0.03),C4組(0.68±0.02)高于A組及B4組(均P<0.01),D組(0.33±0.02)與A組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。TGF-β1蛋白表達B4組(0.10± 0.02)顯著低于A組(0.28±0.04),C4組(0.55±0.03)顯著高于A組和B4組(均P<0.01),D組(0.29±0.02)與A組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

        3 討論

        ERK信號轉(zhuǎn)導通路廣泛存在于多種細胞內(nèi),是MAPK信號通路的3個家族成員之一,目前已發(fā)現(xiàn)它在ASMC上廣泛分布,主要以ERK1、ERK2兩種亞型存在[5-6]。目前認為ASMC釋放很多細胞因子都通過ERK通路激活[7]。早期的很多研究發(fā)現(xiàn)ras-ERK通路的激活對于細胞增殖、DNA合成和細胞周期調(diào)控有重要意義。筆者既往研究也表明,ERK介導的信號轉(zhuǎn)導通路在ASMC增殖中發(fā)揮著十分重要的作用[3-4]。

        PDGF包括4個同二聚體(PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)及1個異二聚體(PDGF-AB)五個亞型。PDGF能促進成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞(SMC)的有絲分裂,尤其對SMC的作用更明顯,使細胞由靜止的G1/G0期進入到細胞周期的增殖期[8],但其具體機制尚不十分明確。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),制作哮喘大鼠模型后,對哮喘組、激素組、對照組進行研究,哮喘組大鼠血清PDGF-AB濃度和p-ERK以及c-Fos濃度高于對照組和激素組,糖皮質(zhì)激素能抑制哮喘大鼠ERK以及c-Fos的磷酸化,并在一定程度上減低支氣管壁和平滑肌的厚度[4]。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)重度哮喘患者支氣管上皮細胞和SMC中磷酸化ERK1/2強表達,與中度哮喘患者和健康志愿者有顯著差異,得出ERK1/2通路調(diào)節(jié)上皮細胞的分泌和增殖功能的結(jié)論。

        本研究發(fā)現(xiàn),以PDGF-BB作用于ASMC后,ASMC內(nèi)的ERK1蛋白及ERK1 mRNA表達均明顯增多,且ERK1 mRNA表達增多與PDGF-BB存在明顯的濃度依賴關(guān)系。使用U0126阻斷ERK通路后,PDGF誘導ERK1蛋白表達增強的效應(yīng)完全被阻斷,ERK1 mRNA表達明顯減少,U0126以濃度依賴的方式抑制PDGFBB誘導上皮細胞ERK的活化,說明PDGF可劑量依賴地激活哮喘大鼠ASMC內(nèi)的ERK通路,ERK通路則參與了ASMC增殖的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程。

        既往研究發(fā)現(xiàn),ERK通路和TGF-β1通路都可促進ASMC增殖,且在許多細胞中ERK途徑和TGF-β1途徑存在交互作用,共同協(xié)調(diào)細胞的生物學行為[10-13]。本實驗中以PDGF作用于哮喘大鼠ASMC后,隨著ERK通路的激活,TGF-β1蛋白表達增加;而以U0126阻斷ERK通路后,TGF-β1蛋白表達隨之減少。由此筆者得出如下推論:PDGF-Ras-Raf-MAPK-ERK通路可能經(jīng)ERK環(huán)節(jié)促進TGF-β1通路活化,其中的具體干預機制仍有待進一步研究。

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        PDGF induces proliferation of airway smooth muscle cells of asthmatic rats through activation of ERK signal pathway

        Objective To investigate the effect of platelet-derived growth factor(PDGF)on proliferation of airway smooth muscle cells(ASMC)in asthmatic rats and its relation to external signal regulated kinase(ERK)signal pathway.Methods Asthma model was established in Sprague-Dawley rats.ASMCs separated from asthmatic rats were divided into four groups:group A without any intervention served as control,group B was treated with ERK blocking agent U0126 0.1μmol/L(B1),1μmol/L(B2), 5μmol/L(B3)or 10μmol/L(B4),group C was treated with recombinant rat PDGF-BB 1μg/L(C1),10μg/L(C2),25μg/L(C3)or 50μg/L(C4),group D was treated with 10μmol/L U0126 and 50μg/L PDGF.The mRNA expressions of ERK1 and TGF-β1 in ASMCs of asthmatic rats were detected by RT-PCR.The protein expressions of ERK1 and TGF-β1 were detected by immunohistochemistry(group A,B4,C4 and D only). Results Compared to group A,the expressions of ERK1 mRNA in ASMCs of groups B1,B2,B3 and B4 were significantly decreased(P<0.01)in a concentration-dependent manner;while the expressions of ERK1 mRNA in groups C1,C2,C3 and C4 were significantly increased(P<0.01)in a concentration-dependent manner.There was no significant difference in expressions of ERK1 mRNA between group D and group A(P>0.05).Immunohistochemistry showed that the expression of P-ERK1 in ASMCs of group B4 was significantly lower and that of group C4 was higher than that in group A(both P<0.01);while there was no significant difference between group D and group A(P>0.05).Conclusion PDGF can induce the proliferation of airway smooth muscle cells of asthmatic rats,in which the activation of ERK signal pathway is involved.

        Asthma Airway smooth muscle cells External signal regulated kinase Airway remodeling TGF-β1

        2012-12-10)

        (本文編輯:胥昀)

        國家自然科學基金項目(30571981;30271383)

        325027 溫州醫(yī)科大學育英兒童醫(yī)院呼吸科(盧虹蓓系碩士研究生,現(xiàn)在麗水市中心醫(yī)院兒科工作)

        李昌崇,E-mail:wzlichch@21cn.com

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