張興超，張紹政，彭龍鋒，曲紹霞，姜京超，高培龍

生存素(Survivin)是近來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，在正常成人組織中不表達(dá)，而在顱腦損傷后高表達(dá)，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用［1］。鹽酸納美芬在顱腦創(chuàng)傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不清楚［2］。本研究采用自由落體法大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，觀察鹽酸納美芬對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后傷側(cè)腦組織Survivin、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響，以探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料與方法

1 主要儀器和試劑

Epics XL流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becman-Coulter公司)，BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);Caspase-3 P20多克隆抗體(兔抗)、Survivin多克隆抗體(兔抗)為Santa Cruz公司產(chǎn)品，SP試劑盒(抗兔IgG)和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鹽酸納美芬注射液(成都天臺(tái)山制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20080645)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康雄性Wistar大鼠，無特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量(260±20)g［由甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(甘)2004-007］，隨機(jī)分為假手術(shù)組(6只)、顱腦創(chuàng)傷組(36只)及納美芬治療組(36只)。假手術(shù)組在傷后1d取材，余兩組均在傷后1、2、3、5、7、14d分別取材，每時(shí)間點(diǎn)各6只。

3 動(dòng)物模型的建立

采用Feeney法制作顱腦創(chuàng)傷模型［3］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，頭部固定于立體定向儀上，沿中線切開頭皮，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm、中線旁2.5mm處鉆孔并擴(kuò)大為一直徑5mm骨窗，保持硬膜完整。用40g砝碼分別于25cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，致右頂葉腦挫裂傷，硬膜外置明膠海綿止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。按分組規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦。假手術(shù)組除不打擊外，其它步驟同上。治療組于顱腦創(chuàng)傷后立即一次性皮下注射鹽酸納美芬(0.1mg/kg)［4］。

4 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Survivin、Caspase-3表達(dá)

大鼠斷頭取腦，用4%中性多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，以視交叉和乳頭體中部為切面行冠狀切片，片厚5μm。采用SP法檢測(cè)Survivin和Caspase-3的表達(dá)(按SP法步驟進(jìn)行)，陰性對(duì)照為不加一抗。在光鏡下觀察Survivin、Caspase-3免疫反應(yīng)的結(jié)果，陽性染色定位于胞漿和(或)核膜，呈黃色。采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像定量分析。Survivin和Caspase-3免疫組化染色標(biāo)記強(qiáng)度用光密度值(optical density，OD)表示，比較各組OD值。

5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

取損傷灶處新鮮腦組織約100～150mg，于磷酸緩沖液(PBS)中勻漿，勻漿后組織用400目篩網(wǎng)過濾，濾液放離心管中，1000r/min離心5min，PBS洗2次，再加70%乙醇固定，4℃過夜。次日離心去上清，PBS洗1次，加1ml碘化丙啶(PI)染液(濃度為50μg/ml，含生理鹽水32.4ml，PI 2.5mg，核糖核酸酶(Rnase)0.5mg，聚乙二醇辛基苯基酸(Triton-X-100)0.25ml，枸櫞酸鈉50mg，加蒸餾水至50ml)，4℃避光條件下染色30min。應(yīng)用Epics XL流式細(xì)胞儀記錄氬離子激發(fā)光波長(zhǎng)488nm處紅色熒光，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞凋亡的百分率為檢測(cè)指標(biāo)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的變化

顱腦創(chuàng)傷組各時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均較假手術(shù)組增高，傷后2d達(dá)高峰，此后逐漸下降，但直至傷后14d仍顯著高于假手術(shù)組水平(P＜0.05)。納美芬治療組各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞凋亡率較顱腦創(chuàng)傷組均明顯降低(P＜0.05)(見圖1、表1)。

2 Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

顱腦創(chuàng)傷后3d在傷側(cè)腦組織中可見Survivin少量表達(dá)，7d達(dá)高峰，3、5、7、14d組與假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P＜0.05);納美芬治療后1d即見Survivin表達(dá)，之后表達(dá)明顯增加，5d達(dá)高峰，與顱腦創(chuàng)傷組各時(shí)相點(diǎn)相比，Survivin表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)(見圖2、3)。Caspase-3在傷后1d達(dá)高峰，后逐漸下降，14d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);納美芬治療組各時(shí)相點(diǎn)傷側(cè)腦組織Caspase-3表達(dá)較顱腦創(chuàng)傷組均明顯降低(P＜0.05)(見圖4、5)。

表1 納美芬治療前后不同時(shí)間點(diǎn)傷側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(±s，%)

表1 納美芬治療前后不同時(shí)間點(diǎn)傷側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(±s，%)

與假手術(shù)組比較:*P＜0.05;與顱腦創(chuàng)傷組比較:ΔP＜0.05

組別1d 2d 3d 5d 7d 14d假手術(shù)組2.16±0.63顱腦創(chuàng)傷組 19.68±0.59* 22.76±1.86* 18.90±1.41* 15.8±1.51* 13.42+1.07* 11.76±1.54*納美芬治療組 15.34±1.12*Δ19.00±0.73*Δ14.14±0.88*Δ12.78±0.83*Δ10.78±0.79*Δ 9.26±1.30*Δ

圖1 流式細(xì)胞儀直方圖

圖2 傷后5d Survivin蛋白陽性表達(dá)(SP×400)

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)Survivin蛋白表達(dá)變化

圖4 傷后1d Caspase-3蛋白陽性表達(dá)(SP×400)

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3蛋白表達(dá)變化

討 論

創(chuàng)傷性顱腦傷是臨床常見的致死性疾病之一，病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)人類健康危害極大，主要原因是繼發(fā)性腦病理改變，而顱腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡促進(jìn)了繼發(fā)性腦損害的發(fā)展，導(dǎo)致病人預(yù)后不良［5］。因此，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為創(chuàng)傷性顱腦傷救治的重要方面。

Caspase-3的激活是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵步驟，它的活化參與了腦缺氧缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并對(duì)決定細(xì)胞凋亡下游事件的激活起重要作用［6］。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中的一個(gè)新成員，它是用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA從人類基因組庫的雜交篩選中將其分離出來，位于染色體17q25，其蛋白含有142個(gè)氨基酸。Survivin在正常分化成熟組織中不表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤組織及顱腦創(chuàng)傷后存在高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其主要通過直接抑制終末效應(yīng)酶，即Caspase-3和Caspase-7的活性來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［1，7］。

納美芬作為最新一代的阿片受體拮抗劑，能與腦內(nèi)的阿片受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷內(nèi)源性阿片肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害，其可通過解除內(nèi)啡呔對(duì)神經(jīng)感覺及運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路的抑制，降低抑制神經(jīng)元興奮性;減少自由基的產(chǎn)生和抗脂質(zhì)過氧化作用，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性;抑制顱腦創(chuàng)傷時(shí)巨噬細(xì)胞的趨化活性，減少炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng);降低內(nèi)皮素，提高降鈣素基因相關(guān)肽水平，保護(hù)神經(jīng)元;抑制興奮性氨基酸釋放及改善神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂，減輕其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害作用;增加腦局部血流和腦灌注壓，改善神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝，減輕腦水腫，而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用［2，4，8－9］。但納美芬是否可以通過上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。筆者通過觀察納美芬對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3和Survivin蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷后早期并無Survivin蛋白明顯表達(dá)，但隨著受傷時(shí)間的延長(zhǎng)，Survivin蛋白表達(dá)逐漸增高，而納美芬治療使Survivin蛋白表達(dá)在傷后早期就出現(xiàn)，達(dá)峰時(shí)間早于顱腦創(chuàng)傷組，與顱腦創(chuàng)傷組各時(shí)相點(diǎn)相比，Survivin蛋白表達(dá)水平顯著升高，且持續(xù)高水平表達(dá)。這說明在顱腦創(chuàng)傷后不但存在Survivin蛋白高表達(dá)，而且納美芬治療可促使其早期高水平表達(dá)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納美芬治療組各時(shí)相點(diǎn)傷側(cè)腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率較顱腦創(chuàng)傷組均明顯降低，并通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)它們之間具有負(fù)相關(guān)性(r=－0.584，P=0.001)。筆者認(rèn)為顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)用納美芬治療可增加抗凋亡蛋白Survivin的合成和分泌，抑制Caspase-3表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞凋亡過程，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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