李應(yīng)祥，王勇

（1.貴州省黔南州茶葉產(chǎn)業(yè)化發(fā)展管理辦公室，黔南苗族自治州都勻 558000；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系，貴陽花溪 550025）

貴州省都勻市茶輪斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性的研究

李應(yīng)祥1，王勇2

（1.貴州省黔南州茶葉產(chǎn)業(yè)化發(fā)展管理辦公室，黔南苗族自治州都勻 558000；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系，貴陽花溪 550025）

對貴州省都勻市出現(xiàn)的茶輪斑病的癥狀進行了系統(tǒng)的描述，采用致病性試驗、形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)的方法對茶輪斑病的病原菌進行鑒定。致病性試驗證實，不同的接種方法對茶葉的致病力均有不同。對病原菌rDNA-ITS區(qū)進行了PCR擴增和序列測定。綜合形態(tài)特征、致病力和分子序列分析結(jié)果，確定茶輪斑病病原菌為茶擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）。

病原菌鑒定，茶輪斑病，茶擬盤多毛孢菌，生物學(xué)特性

中國茶葉加工2013，（3）:37～40

茶產(chǎn)業(yè)在貴州省是繼酒、煙草后的第三大產(chǎn)業(yè)[1]。其中貴州茶葉中又以都勻毛尖茶為佳，都勻毛尖茶生產(chǎn)歷史悠久，迄今已有五百多年的歷史[2]。都勻市氣候溫和，雨量充沛，云霧繚繞，土壤肥沃，是茶樹生長的好地方。尤其是主產(chǎn)都勻毛尖茶的團山、大定兩鄉(xiāng)，茶樹多生于峽谷溪澗兩旁，有蒼翠欲滴的常綠針葉與闊葉喬木為其天然屏障，形成空氣濕潤與多漫射光的優(yōu)良環(huán)境，因而茶樹生長健壯，持嫩期長[3]。但是近年來都勻茶樹病害危害比較嚴重，其中以茶輪斑病最為嚴重。為了能夠更好地對茶輪斑病進行病害綜合防治，在團山、大定兩鄉(xiāng)的主要茶園進行實地考察并進行標本的采集、分離純化及病原菌的鑒定，并對其進行了生物學(xué)特性的初步研究。

1 材料和方法

1.1 病害觀察和描述

2011年至2012年間在貴州省都勻市對茶輪斑病進行觀察，詳細記載和描述茶輪斑病病害癥狀特點，并拍照。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化

采用常規(guī)分離和單孢分離相結(jié)合的方法。

（1）常規(guī)分離的方法步驟：取病健交界處的植株組織，剪成約5mm2大小的組織塊，先在70%的酒精中浸幾秒鐘，再在0.1%的升汞中消毒2min，然后用無菌水洗3次，最后置于PDA上培養(yǎng)[4]；

（2）為了獲得更純的菌株，在顯微鏡10×40倍下挑取單個孢子，置于PDA上培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

選取具有典型癥狀的病害標本，徒手切片、刮取或挑取病部病征，制片，顯微鏡下觀察描述病原菌形態(tài)特征；用無菌的接種針挑取平板培養(yǎng)的菌絲及子實體于顯微鏡下觀察，描繪其形態(tài)，測量50個孢子的大小。根據(jù)病原菌的形態(tài)特點、培養(yǎng)性狀，結(jié)合相關(guān)資料進行病原菌的鑒定。

1.2.3 分子鑒定

首先采用DNA試劑盒進行DNA的提取，然后在ITS等保守的區(qū)域設(shè)計通用引物（ITS1和ITS4），PCR擴展、測序，最后對測序的結(jié)果在NCBI-BLAST上進行序列比對鑒定到屬或種。

1.3 致病力測定

用單孢分離的純菌株在PDA上培養(yǎng)7天，用直徑為0.5cm的打孔器打成菌碟，對新鮮健康的刺傷的寄主（茶葉）葉片進行3個處理分別為針刺、磨砂、剪切。把菌碟粘于各處理葉片上（用75%酒精對其葉片表面消毒），外面遮蓋一層用無菌水侵泡過的脫脂棉保濕，以無菌水脫脂棉保濕作對照，然后將接種的盆栽置于25℃左右的溫室內(nèi)培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，每隔1d觀察1次，記錄接種結(jié)果。

1.4 生物學(xué)特性

（1）生長速度測定：取5mm直徑菌塊置于PDA平板中央，25℃下培養(yǎng)5d，測量菌落直徑。溫度試驗：挑5mm直徑菌塊于PDA平板中央，分別置于溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、35℃條件下培養(yǎng)7d，測量菌落直徑。

（2）pH試驗：PDA培養(yǎng)基分別用0.1mol/L HCL和0.1mol/L NaCL調(diào)pH值至4、5、6、7、8、9、l0、11、12，挑5mm直徑菌塊置于平板中央，在最適溫度下培養(yǎng)5d，測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶輪斑病癥狀

茶輪斑病癥狀多自老葉的葉尖及葉緣發(fā)生，病斑初為黃綠色小點，后漸向內(nèi)擴展成半圓形至圓形或不規(guī)則形褐色大斑，一般直徑為2～3cm。邊緣黑褐色、隆起，后期中部變?yōu)榛野咨?，并產(chǎn)生輪紋，沿輪紋產(chǎn)生黑漆狀扁平小顆粒，見圖1。

圖1 茶輪斑病后期癥狀Fig.1The late symptom of Tea Gray Blight

2.2 茶輪斑病的病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

在營養(yǎng)充足的情況下，在PDA培養(yǎng)基上茶輪斑病病原菌生長8天即可長滿直徑為9cm培養(yǎng)皿，菌落邊緣平整，菌絲為白色或無色，菌落呈現(xiàn)出很明顯的輪紋狀，見圖2-A，菌落的背面會呈現(xiàn)淡黃色，見圖2-B。分生孢子盤扁平，大小0.5× 0.09mm，黑漆狀，見圖2-C，分生孢子盤中堆積著大量的分生孢子，見圖2-D。分生孢子紡錘形、無色，具4個隔膜，兩端細，頂部2、3個細胞黑色至黑褐色，基部第2個細胞淡褐色。孢子大小24[+,-]μm×9[+,-]μm，頂端細胞上生有2～3根附屬絲（個別有4根），見圖2-E、2-F、2-G。

注：A-B為PDA培養(yǎng)物正反面，C為分生孢子盤，D、E、F、G為分生孢子；圖中標尺均為20μm。Note:(A-B)Colony on PDA(A:from above,B:from below).(C)Acervulus.(D,E,F,G)Conidia.Scale bar=20μm.

2.2.2 分子鑒定

茶輪斑病病原菌ITS測序結(jié)果：

在NCBI上該種的ITS序列與Pestalotiopsis theae的epitype菌株（MFLUCC12-0055）的ITS序列（JQ683727）進行比對，結(jié)果證實為茶擬盤多毛孢菌[P.theae(Saw.)Stey.]。

2.3 病原菌的致病力檢測

接種病原菌在各個處理茶葉葉片上，3d后大部分茶葉葉片開始發(fā)病，癥狀與自然發(fā)病的相似。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和ITS測序結(jié)果可知，茶輪斑病是由茶擬盤多毛孢真菌侵染所致。其中針刺、磨砂、剪切的接種發(fā)病率分別為85%、90%、100%，見表1，即接種效果差異為：剪切＞磨砂＞針刺。

表1 各個處理接種發(fā)病情況Table1 The disease incident of inoculation in different managements

2.4 生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響

茶輪斑病菌在5～35℃均可以存活，低于5℃、高于35℃均不能生長，最適溫度為25℃，見表2，菌落直徑可以達到69.8mm。

表2 溫度對茶輪斑病菌落直徑的影響Table2 Effect of temperature on the diameter of Tea Gray Blight colony

2.4.2 pH值對菌絲生長的影響

茶輪斑病菌在pH4～12間均可生長均可以存活，pH低于4或高于12均不能生長，最適pH為7，見表3，菌落直徑可以達到68.5mm。

表3 pH對茶輪斑病菌落直徑的影響Table3 Effect of pH on the diameter of Tea Gray Blight colony

3 討論

通過對茶輪斑病癥狀的詳細觀察記錄，病原菌的分離培養(yǎng)特點，ITS測序結(jié)果以及致病性測定結(jié)果，確定茶輪斑病病原菌為茶擬盤多毛孢菌。該菌生長的最適溫度為25℃，最適pH值為7，但是該菌的產(chǎn)孢情況還有待于進一步的研究。

[1]江用文,程啟坤.中國茶業(yè)年鑒(2008)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008:1-520.

[2]陸興和.黔南年鑒(2006)[M].貴陽:貴州人民出版社,2006:440-441.

[3]陸興和.黔南年鑒(2005)[M].貴陽:貴州人民出版社,2005:292.

[4]方中達.植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

The Identification of Tea Gray Blight Pathogen and Study of Biological Characters in Duyun City,Guizhou Province

LI Ying-xiang1,WANG Yong2

(1.The Tea Development and Management Office of Qiannan Miao Nationality Autonomic Eparchy,Duyun 558000,China; 2.Department of Plant Pathology,Agriculture College,Guizhou University,Guiyang,Huaxi 550025,China)

This study detailedly described the symptom of tea gray blight in Duyun city, Guizhou Province. The pathogenic test, morphological observation and molecular method were used for identification of pathogenic fungus. The pathogenic test confirmed that different inoculation methods influenced the pathogenicity. It also amplified the rDNA-ITS by PCR reaction and sequenced it. Integrated morphological characters, pathogenicity and molecular analysis, it is concluded that the pathogen of tea gray blight wasPestalotiopsis theae.

Pathogenic identification,Tea gray blight,Pestalotiopsis theae,Biological characters

S571.1

A

2095-0306（2013）03-0037-04

2013-07-19

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合NY字[2011]3045號）

李應(yīng)祥（1971-），男，貴州平塘人，高級經(jīng)濟師，主要從事茶產(chǎn)業(yè)行政管理及技術(shù)指導(dǎo)服務(wù)工作。