孔俊豪，張士康，禹超，梁慧玲，譚蓉，涂云飛，楊秀芳

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

茶樹鮮葉發(fā)酵制備速溶紅茶的工藝優(yōu)化研究

孔俊豪，張士康，禹超，梁慧玲，譚蓉，涂云飛，楊秀芳*

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

以暑茶勻漿鮮葉為原料，對液態(tài)發(fā)酵制備高茶黃素速溶紅茶進(jìn)行研究?？疾炝税l(fā)酵溫度、時間、pH、氧氣流量等因素對發(fā)酵液中茶黃素積累量的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上通過CCD實驗設(shè)計和結(jié)果分析，得到了優(yōu)化的液態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)。結(jié)果表明：溫度33.2℃，時間45min，pH4.2，氧氣流量0.96L/min發(fā)酵條件下，制得速溶紅茶產(chǎn)品中茶黃素含量達(dá)2.1%，高于同類市售產(chǎn)品中茶黃素含量的平均水平。

茶樹鮮葉，速溶紅茶，茶黃素，工藝優(yōu)化

上世紀(jì)70年代開始，國外研究者利用多酚氧化酶加速茶葉發(fā)酵制造高質(zhì)量的速溶紅茶，近年來國內(nèi)液態(tài)發(fā)酵技術(shù)的相關(guān)研究也先后見諸報道，但未見付諸實際生產(chǎn)。本研究基于前期茶黃素生物合成的研究基礎(chǔ)[1-2]，根據(jù)茶黃素生物合成的主因效應(yīng)確定的溫度、pH、時間、通氣流量等影響因素，從單因素到響應(yīng)模型的建立，重點考察了各因素的作用區(qū)間及其對發(fā)酵過程中茶黃素濃度的影響，著眼于企業(yè)實際技術(shù)需求進(jìn)行了茶樹鮮葉定向轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)一步探索，以期對速溶紅茶生產(chǎn)工藝改進(jìn)有所裨益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮葉原料（福鼎大白，采自杭州茶葉試驗場）；兒茶素單體、咖啡堿標(biāo)樣：Sigma公司；乙腈：色譜純，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JPR-2雙層玻璃反應(yīng)釜，杭州歐爾柏維科技有限公司；低溫恒溫反應(yīng)浴，杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司；LZB-4WB(F)玻璃轉(zhuǎn)子流量計，常州市成豐流量儀表有限公司；1525HPLC，Waters公司；MJ-250BP02A植物組織搗碎機，廣州美的生活電器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮葉預(yù)處理方法

采后鮮葉風(fēng)扇降溫，25℃攤放萎凋18h，轉(zhuǎn)入‐20℃冰箱凍存，備用。凍存鮮葉采用勻漿破碎方法進(jìn)行處理，4℃預(yù)冷備用。

1.3.2 鮮葉酶促發(fā)酵工藝

鮮葉低溫勻漿，將勻漿液1L加入反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)體系pH，控制反應(yīng)條件進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵。反應(yīng)體系溫度15～40℃，氧氣流量0～3L/min，攪拌轉(zhuǎn)速180～400rpm，發(fā)酵結(jié)束100℃滅酶5min，過濾離心，上清液濃縮干燥。

1.3.3 茶多酚、兒茶素、茶黃素、游離氨基酸總量測定

參照GB/T 21727-2008《固態(tài)速溶茶兒茶素類含量的檢測方法》及ISO14502-2:2005《Determinationofsubstancescharacteristicof green and black tea-Part 2:Content of catechins in green tea—Method using high-performance liquid chromatography》、GB/T 8314-2002《茶游離氨基酸總量測定》。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用Excel、Design-expert軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要初始條件對鮮葉發(fā)酵的影響

2.1.1 溫度條件對茶黃素積累量的影響

在pH4.8、氧氣流量1L/min條件下，分別考察了反應(yīng)體系在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下反應(yīng)時間30min對茶黃素積累量的影響。

圖1 不同初始溫度對茶黃素積累量的影響Fig.1Effects of different initial temperature on the accumulation of TFs

由圖1可以看出，在酶促反應(yīng)考察時間范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，發(fā)酵液中茶黃素積累濃度呈上升趨勢。不同溫度影響酶催化速率的快慢，進(jìn)而影響反應(yīng)平衡的進(jìn)程，反應(yīng)初期階段，茶黃素作為連串反應(yīng)的中間產(chǎn)物，體系溫度越低，反應(yīng)速率越慢[3]，體系溫度越高，反而有利于茶黃素的積累。

2.1.2 時間對茶黃素積累量的影響

在pH4.8、溫度35℃、氧氣流量1L/min條件下，考察了反應(yīng)體系中茶黃素濃度隨反應(yīng)時間的變化，結(jié)果見圖2。

圖2可見，發(fā)酵過程中茶黃素積累量隨著發(fā)酵時間的延長出現(xiàn)先升后降的倒“V”型變化，60min時測得茶發(fā)酵液中茶黃素積累濃度達(dá)到該體系下的峰值：0.7mg/mL，隨著茶黃素參與連串反應(yīng)，茶紅素、茶褐素等大分子的合成速率大于茶黃素的合成速率，茶黃素積累量開始下降[4]。因此嚴(yán)格控制發(fā)酵時間對于茶黃素的發(fā)酵終點濃度尤為必要。

圖2 發(fā)酵時間對茶黃素積累量的影響Fig.2Effects ofoxidation time on the accumulation of TFs

圖3 pH對茶黃素積累量的影響Fig.3Effects of initial pH on the accumulation of TFs

2.1.3 pH對茶黃素積累量的影響

在反應(yīng)溫度35℃、氧氣流量1L/min、反應(yīng)時間90min條件下，考察了不同pH反應(yīng)體系中茶黃素發(fā)酵終點濃度的變化，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，發(fā)酵體系pH對茶黃素的合成具有顯著性的影響。pH越低，茶黃素積累量越大，pH越高，茶黃素濃度越低。這與茶黃素的氧化傾向有關(guān)，高酸度環(huán)境下，PPO催化活性的適應(yīng)性提高，利于茶黃素的合成，中性偏堿環(huán)境下，茶黃素不穩(wěn)定，更易于形成高聚物色素。

2.1.4 氧氣流量對茶黃素積累量的影響

對氣流流量的研究（圖4）表明，隨著氣流流量增大，體系中茶黃素濃度出現(xiàn)平行下降的趨勢，就發(fā)酵過程參量而言，氣流流量對反應(yīng)速率的影響并不明顯，溶氧率才是影響反應(yīng)速率的直接因素。實驗條件下出現(xiàn)的結(jié)果，其可能原因是反應(yīng)規(guī)模不變的情況下，由于高氣流速度產(chǎn)生液泛而使泡沫增加，傳質(zhì)速率降低，影響了發(fā)酵效率。

圖4 氧氣流量對茶黃素積累量的影響Fig.4 Effects of oxygen flow on the accumulation of TFs

2.2 液態(tài)深層發(fā)酵工藝的響應(yīng)優(yōu)化

選擇對TFs積累濃度影響相對較大、過程可控的4個因素：發(fā)酵溫度、體系pH、發(fā)酵時間、氧氣流量進(jìn)行CCD設(shè)計，其設(shè)計水平和編碼見表1。

通過計算二次模擬回歸系數(shù)，得到如下方程表征上述4因素對發(fā)酵液中茶黃素的濃度的影響：

表1 CCD設(shè)計因素水平編碼表Table 1 Coding tables of factor level for CCD design

響應(yīng)面方差分析表明，模型p值為0.004（p＜0.01），多元相關(guān)系數(shù)R2=0.996，失擬項p值為0.82（p＞0.05），說明該模型高度顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測。

由表3可見，A、C、AB、AC對TFs的累積濃度具有顯著性影響，與前人研究的結(jié)果基本一致[2]。其中A（溫度）、B（時間），A（溫度）、C（pH）之間均具有一定的交互作用。

根據(jù)回歸方程求一階偏導(dǎo)得Y(發(fā)酵液中TFs濃度)的極值點為：溫度=33.2℃，時間=45min，pH= 4.2，氧氣流量=0.96L/min，此時茶湯中TFs的濃度預(yù)測值為1.2mg/mL。

2.3 最佳工藝條件驗證實驗

按照優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行10倍放大實驗，實測鮮葉發(fā)酵液中TFs濃度為1.1mg/mL（HPLC檢測結(jié)果見圖5），和預(yù)測值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于茶鮮葉發(fā)酵程度的預(yù)測。

發(fā)酵液滅酶，濃縮干燥，得到的樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果見表4。

3 討論

本研究將單因素與相應(yīng)分析相結(jié)合，采用調(diào)控處理鮮葉為原料進(jìn)行液態(tài)控制發(fā)酵工藝條件的系統(tǒng)研究和模型優(yōu)化。經(jīng)響應(yīng)優(yōu)化后的最佳液態(tài)發(fā)酵工藝條件為：溫度33.2℃，時間45min，pH4.2，氧氣流量0.96L/min，此條件下的放大實驗實測發(fā)酵液中茶黃素的濃度為1.1mg/mL，試制樣品中茶黃素含量為2.1%。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與實驗結(jié)果Table 2 Response surface design and experiments results

表3 TFs濃度值為響應(yīng)的因素方差分析Table 3 Factor variance analysis based on the concentration of TFs

圖5 發(fā)酵液組分的HPLC檢測圖Fig.5Component analysis of tea infusion by HPLC

表4 新工藝速溶紅茶及市售速溶紅茶主要理化組分比較（單位：%）Table 4 Comparison of main physical chemical components between new technology instant tea and market instant tea(Unit:%)

液態(tài)發(fā)酵體系均一、理化因子易監(jiān)控、操作性強，成為研究紅茶發(fā)酵的良好體系。將紅茶提質(zhì)技術(shù)應(yīng)用于鮮葉液態(tài)發(fā)酵過程，可顯著增強速溶紅茶的特征品質(zhì)[5]。作為速溶紅茶轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵工序，液態(tài)發(fā)酵過程控制是研究的難點。

毛清黎等[6]曾在懸浮發(fā)酵試驗中考察了pH調(diào)控對紅碎茶發(fā)酵的影響，酸處理可促進(jìn)多酚類物質(zhì)向茶黃素的有效轉(zhuǎn)化。有關(guān)發(fā)酵溫度與紅茶品質(zhì)關(guān)系的研究,一度見解不一，但從提高茶黃素積累量角度考慮，變溫發(fā)酵逐漸成為學(xué)界的一種共識[7-8]，發(fā)酵過程自身產(chǎn)熱對發(fā)酵的影響尚待進(jìn)一步考察。在恒定溫度、pH和供氧量條件下，發(fā)酵過程中茶黃素含量隨發(fā)酵時間呈單峰型變化，本研究的結(jié)果表明，由于交互作用的存在，發(fā)酵時間的考慮應(yīng)該放在一定的體系中才有實際意義。

與pH、溫度、時間等因素的影響相比較，調(diào)控氧氣流量對發(fā)酵的影響相對較弱，體系溶氧能力成為實際上的影響因素，故發(fā)酵體系的供氧能力便成為懸浮發(fā)酵的限制因子。

因此，除了發(fā)酵初始因素的控制，在液態(tài)發(fā)酵過程中諸如溶氧率、發(fā)酵溫度的實時調(diào)控，成為影響速溶紅茶發(fā)酵效率和產(chǎn)品品質(zhì)不可忽視的因素，有待進(jìn)一步的研究和探索。

[1]孔俊豪,楊秀芳,張士康,等.基于響應(yīng)曲面法的茶黃素發(fā)酵工藝優(yōu)化[C]//2012國際(杭州)茶資源綜合利用學(xué)術(shù)研討會論文集.杭州:論文集編輯組,2013:324-333.

[2]孔俊豪,楊秀芳,涂云飛,等.基于SPSS空列正交設(shè)計的茶黃素動態(tài)提制工藝快速優(yōu)化[J].中國茶葉加工,2011,(3):10-14.

[3]JohnB,Cloughley.Theeffectoftemperatureonenzyme activityduringthefermentationphaseofblacktea manufacture[J].JournaloftheScienceofFoodand Agriculture,1980,31(9):920-923.

[4]Thomas Muthumani,R.S.Senthil Kumar.Influence of fermentation time on the development of compounds responsible for quality in black tea[J].Food Chemistry,2007,101(1):98-102.

[5]禹超,楊秀芳,孔俊豪,等.茶鮮葉酶促發(fā)酵過程中內(nèi)質(zhì)變化及速溶紅茶品質(zhì)研究[EB/OL].[2013-06-01].http://www.paper. edu.cn/releasepaper/content/2012-11-93.

[6]毛清黎,朱旗,劉仲華,等.紅茶發(fā)酵中pH調(diào)控對多酚氧化酶活性及茶黃素形成的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005,31(5):524-526.

[7]夏濤,高麗萍.茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵體系優(yōu)化模型[J].茶葉科學(xué),1999,19(1):55-60.

[8]陳以義,江光輝.紅茶變溫發(fā)酵的理論探討[J].茶葉科學(xué), 1993,13(2):81-86.

Optimization of Fermentation Technology of Instant Black Tea from Fresh Tea Leaves

KONG Jun-hao,ZHANG Shi-kang,YU Chao,LIANG Hui-ling,TAN Rong,TU Yun-fei,YANG Xiu-fang*
(Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

Summer tea leaves homogenate as raw material,and through liquid fermentation,to improve the technology of high theaflavins content instant black tea.The effects of factors including fermentation temperature, time,pH,and oxygen flow rate on the accumulation of theaflavins were explored by single-factor and central composite design.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follow:temperature 33.2℃, time 45min,pH4.2,oxygen flow rate 0.96L/min.Under optimal conditions,theaflavins content of the product prepared up to 2.1%,which was higher than that of the average level of similar products.

Fresh tea leaves,Instant black tea,Theaflavins,Process optimization

TS272.5

A

2095-0306（2013）03-0018-06

2013-07-08

國家質(zhì)檢公益項目（201110210），浙江省茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟專項資金項目（2010LM201）

孔俊豪（1982-），男，河南漯河人，助理研究員，主要從事茶葉功能成分生物制備技術(shù)研究。

*通訊作者：teateasting@sina.com

中國茶葉加工2013，（3）:18～22，27