高玉萍，涂云飛，楊秀芳*，梁慧玲，孔俊豪，龔淑英

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058）

茶多酚制品中多酚含量測定方法比較研究

高玉萍1,2，涂云飛1，楊秀芳1*，梁慧玲1，孔俊豪1，龔淑英2*

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058）

對(duì)福林酚比色法和酒石酸亞鐵比色法測定茶多酚制品中多酚含量的適用性進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：兩種方法在測定茶多酚制品的多酚含量時(shí)都有良好的穩(wěn)定性（RSD＜5.1）；兩者的測定原理不同，測得的結(jié)果具有一定的差距，純度越高的茶多酚制品，兩種方法測定值之間差距越大；用酒石酸亞鐵比色法測得的多酚含量有超出100%的現(xiàn)象，福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得的多酚含量在30.08%～88.76%之間。茶多酚制品中多酚含量宜采用福林酚比色法測定，即福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和福林酚-換算系數(shù)法，且換算系數(shù)為88.13μg/mL。

茶多酚制品，多酚含量，測定方法，酒石酸亞鐵，福林酚

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，由兒茶素類、黃酮類、黃酮醇類、花青素類、花白素類、酚酸及縮酚酸類等物質(zhì)組成，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、防癌抗癌及調(diào)節(jié)免疫等功效[1]，并應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化學(xué)品、飼料等領(lǐng)域[2-3]。我國茶資源豐富，利用中低檔茶、碎末茶與夏秋茶提取茶多酚的工藝已非常成熟。目前，全國大約有近百家規(guī)模不一的茶葉深加工企業(yè)，如安徽紅星藥業(yè)、江西綠康、浙江東方、無錫世紀(jì)生物、浙江瑞安派諾等。隨著茶多酚行業(yè)的快速發(fā)展，市場亟需一個(gè)統(tǒng)一的產(chǎn)品質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)去規(guī)范和引領(lǐng)，茶多酚制品產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和測定方法標(biāo)準(zhǔn)等相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系有待建立。

目前茶葉中茶多酚總量的測定方法主要包括酒石酸亞鐵絡(luò)合多酚顯色法[4-8]和福林酚氧化多酚顯色法[9-12]。酒石酸亞鐵比色法的原理是在一定的pH條件下茶葉中的多酚類物質(zhì)與亞鐵離子形成藍(lán)紫色絡(luò)合物，是絡(luò)合反應(yīng)；福林酚比色法則是利用福林酚試劑氧化茶多酚中的-OH，并顯藍(lán)色，是氧化還原反應(yīng)[13]。在國家標(biāo)準(zhǔn)和國際標(biāo)準(zhǔn)[9-10]體系中，茶葉及速溶茶中多酚含量的測定已采用福林酚比色法。但茶多酚制品中多酚含量的測定，至今只有1995年發(fā)布的輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中有所涉及，即茶多酚行業(yè)內(nèi)正在廣泛應(yīng)用的酒石酸亞鐵比色法。該法是否還適用于當(dāng)前茶多酚含量的測定，值得探討。因此，本文擬通過分光光度法進(jìn)一步比較分析酒石酸亞鐵比色法和福林酚比色法在測定茶多酚制品中多酚含量上的適用性，為茶多酚制品中多酚含量檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

不同規(guī)格的茶多酚制品購自多個(gè)國內(nèi)茶多酚生產(chǎn)企業(yè)；兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品（EGCG、GCG、ECG、EGC、EC，純度≥98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品由國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供；福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑購自上海聚源生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉（純度≥99.0%）購自上海美興化工有限公司；七水硫酸亞鐵（純度≥99.0%）購自衢州巨化試劑有限公司；無水碳酸鈉（純度≥98%）購自上海美興化工有限公司；沒食子酸乙酯（純度≥98%）購自成都西亞化學(xué)試劑科技有限公司；一水合沒食子酸（純度≥98.5%）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）購自天津市康科德科技有限公司；冰醋酸（純度≥99.5%）購自杭州化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

紫外可見光分光光度計(jì)購自尤尼柯上海儀器有限公司；Waters高效液相色譜儀配備Waters 1525雙元泵、柱溫箱、2487雙通道紫外可見檢測器、717plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze控制軟件，購自Waters科技（上海）有限公司；AL204電子天平購自梅特勒—托利多儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室級(jí)純水器購自南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 多酚含量測定

準(zhǔn)確稱取0.1g茶多酚樣品于燒杯中，加入小于60℃水25mL左右，充分溶解后冷卻定容至100mL容量瓶中，即為1mg/mL的母液，待用。酒石酸亞鐵比色即用母液，福林酚比色時(shí)取2.5mL母液定容至50mL容量瓶中。酒石酸亞鐵比色法基于中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（QB 2154-95）[6]，即1mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入5mL酒石酸亞鐵試劑，充分混勻后用pH7.5的磷酸緩沖液定容至25mL，于540nm測定1cm比色皿中的吸光值；福林酚比色法參照ISO標(biāo)準(zhǔn)[9]執(zhí)行，即1mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入5mL 10%的福林酚試劑后，于3～8min內(nèi)加入4mL 7.5%的碳酸鈉溶液混勻，反應(yīng)60min后，于765nm處測定吸光值。

1.4 茶多酚含量計(jì)算

1.4.1 福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

用沒食子酸（10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算茶多酚含量：

式中：E為根據(jù)試樣測得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒食子酸相應(yīng)含量，μg/mL；V為樣品溶液的體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；d為測得吸光度前的稀釋因子（本實(shí)驗(yàn)中將2.5mL稀釋到50mL，稀釋因子即為20）；m為樣品質(zhì)量，g；G為試樣水分，%；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0109x+ 0.0084，R2=0.9992。

1.4.2 酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

用沒食子酸乙酯50mg/100mL、100mg/100mL、150mg/100mL、200mg/100mL、250mg/100mL作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式求出茶多酚含量：

式中：E為根據(jù)試樣測得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒食子酸乙酯相應(yīng)含量，mg/100mL；1.5為茶多酚的換算系數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg；G為試樣水分，%；沒食子酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.0057x-0.0051，R2=0.9998。

1.4.3 酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法

行業(yè)中常采用酒石酸亞鐵法結(jié)合2.884的換算系數(shù)計(jì)算茶多酚含量，按照下式計(jì)算茶多酚含量：

式中：A為吸光度；V為試樣體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；m為樣品質(zhì)量，mg；G為試樣水分，%。

1.5 兒茶素含量測定

兒茶素含量測定采用高效液相色譜法[14]，并以咖啡堿作為內(nèi)標(biāo)定量各成分。液相色譜洗脫條件為100%初始相A相（純水含有9%的乙腈，2%的冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na）維持10min，然后流動(dòng)相B（80%乙腈，2%冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na的水溶液），經(jīng)15min線性梯度增加至32%，維持10min，再1min回至初始流動(dòng)相A，平衡10min，準(zhǔn)備下一針樣品分析。流速為1mL/min，色譜柱為Hypersil ODS-C18（250mm× 4.6mm i.d.），柱溫35℃±0.5℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用辦公軟件Office Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測定方法的穩(wěn)定性比較

隨機(jī)選取高、中、低三種純度的茶多酚樣品（A、B、C）進(jìn)行測定方法的穩(wěn)定性比較。采用三種不同的處理方式，對(duì)兩種不同的測定方法（福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法）進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。由表1可知，無論是福林酚比色法還是酒石酸亞鐵比色法，其RSD都在合理的范圍內(nèi)（RSD＜5.1%）。這說明，從穩(wěn)定性的角度來看，兩種方法都是可行的。

表1 兩種方法的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)（n=6）Table 1 Comparison of stability of two methods(n=6)

2.2 不同測定方法所得結(jié)果的數(shù)值比較

表2為不同方法測得的茶多酚制品中兒茶素及茶多酚總量結(jié)果，由數(shù)據(jù)分析可以看出，若以福林酚法的數(shù)據(jù)為依據(jù)，兒茶素約占茶多酚總量的73%，說明兒茶素總量在多酚中的分布與茶葉相似。不同方法測得多酚含量數(shù)據(jù)高低依次為：酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法＞酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法＞福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法。在茶多酚純度較低的情況下，三種方法的差距較小，隨著茶多酚純度的增加，三種方法所得結(jié)果之間的差距越來越大。酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法與福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為0.14%～23.95%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為2.36%～34.99%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法之間的差距為1.87%～11.04%。同時(shí)，由這些數(shù)據(jù)可以獲得三種方法所得結(jié)果的換算公式：

其中：X為根據(jù)福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值；

Y1為根據(jù)酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值；

Y2為根據(jù)酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法計(jì)算得到的茶多酚含量數(shù)值。

分析還發(fā)現(xiàn)，利用酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得的結(jié)果中，共4個(gè)樣品的數(shù)據(jù)超過100%，酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法的數(shù)據(jù)更高，共9個(gè)樣品超出100%。而福林酚方法得到的結(jié)果均在100%以內(nèi)。這表明，在利用酒石酸亞鐵比色法測定茶多酚制品中的多酚含量時(shí)，行業(yè)中廣泛使用的換算系數(shù)過高，而利用標(biāo)準(zhǔn)曲線也不能夠獲得關(guān)于茶多酚純度的準(zhǔn)確可信的數(shù)據(jù)結(jié)果。因此判斷，現(xiàn)有的兩種利用酒石酸亞鐵比色法測定多酚含量的方式都不能適用于茶多酚制品中多酚含量的測定。利用福林酚方法測得的結(jié)果中，多酚含量的范圍為30.08%～88.76%。

表2 不同方法測得的茶多酚含量及樣品兒茶素總量Table 2 Total polyphenols'content measured by different methods and total catechins content of samples

2.3 福林酚—換算系數(shù)法研究

現(xiàn)有的福林酚比色法是利用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量多酚含量的，若可以在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)不同時(shí)間、不同樣品、不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量獲得一個(gè)換算系數(shù)，便可節(jié)約大量的時(shí)間與成本。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)37個(gè)樣品的福林酚方法測得的茶多酚含量，計(jì)算獲得福林酚方法的換算系數(shù)：

式中：ω為根據(jù)福林酚方法結(jié)合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的茶多酚含量，%；m為樣品質(zhì)量，g；G為試樣水分，%；A為吸光度；V為樣品提取液的體積，mL（本實(shí)驗(yàn)中為100mL）；d為測得吸光度前的稀釋因子（本實(shí)驗(yàn)中將2.5mL稀釋到50mL，稀釋因子即為20）。

取37個(gè)樣品的平均值，得到福林酚比色法的換算系數(shù)為88.13μg/mL，即單位吸光度對(duì)應(yīng)的多酚濃度為88.13μg/mL。利用該換算系數(shù)得到的多酚含量計(jì)算公式為：

式中字母的含義與上式相同。

由該公式換算得到的樣品茶多酚含量的范圍為30.51%～89.36%，與福林酚—標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的結(jié)果基本吻合。

3 結(jié)論

現(xiàn)階段茶多酚制品中多酚含量的測定，仍然采用我國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2154-1995《食品添加劑茶多酚》，即用酒石酸亞鐵比色法，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算或業(yè)內(nèi)以該標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，用經(jīng)驗(yàn)系數(shù)2.884進(jìn)行換算。但是從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看來，利用酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法與酒石酸亞鐵-標(biāo)準(zhǔn)曲線法，所獲得的茶多酚含量均有高于100%的現(xiàn)象，說明利用這兩種方式對(duì)茶多酚制品中茶多酚的含量進(jìn)行測定時(shí)，測定結(jié)果偏高，不能準(zhǔn)確反映茶多酚的實(shí)際含量。

福林酚法已作為國際標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用于茶葉和速溶茶制品中多酚含量的測定，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》等同采用ISO 14502-1:2005《福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑比色法測定茶葉中茶多酚總量》，以福林酚方法取代酒石酸亞鐵比色法測定茶葉中的茶多酚含量。本文利用福林酚—標(biāo)準(zhǔn)曲線法開展了茶多酚制品中茶多酚含量的測定，發(fā)現(xiàn)測定方法簡單、重復(fù)性好，37個(gè)純度各異的茶多酚制品的測定結(jié)果處于30.08%～88.76%范圍之間。同時(shí)通過分析茶多酚測定結(jié)果數(shù)據(jù)，獲得了更簡單的測定方法，即福林酚—換算系數(shù)法，其中換算系數(shù)為88.13μg/mL，利用該換算系數(shù)得到的茶多酚含量范圍為30.51%～89.36%。

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Methods Comparison of Determinating the Polyphenols Content in Tea Polyphenols Products

GAO Yu-ping1,2,TU Yun-fei1,YANG Xiu-fang1*,LIANG Hui-ling1,KONG Jun-hao1,GONG Shu-ying2*
(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China; 2.Department of Tea Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Tea polyphenol product is a kind of complex product extracted from tea.Applicability of ferrous tartrate method and Folin-Ciocalteu method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products were discussed in this paper.The results showed that both of them were stable with RSD＜5.1.Two methods had different results,because the measuring principles of them were different.As the purity of tea polyphenol products improving,differences between two methods'results were bigger.Status of Folin-Ciocalteu-standard curve method ranged from 30.08%to 88.76%while several data of ferrous tartrate method exceeded 100%.It was summarized that Folin-Ciocalteu methods including Folin-Ciocalteu-standard curve method and Folin-Ciocalteu-conversion ratio method were better than ferrous tartrate method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products and it was calculated that the conversion coefficient was 88.13μg/mL.

Tea polyphenols products,Total polyphenols'content,Methodologies,Ferrous tartrate, Folin-Ciocalteu

TS272.5；Q946.8

A

2095-0306（2013）03-0028-05

2013-06-17

國家質(zhì)檢公益項(xiàng)目（201110210）

高玉萍（1988-），女，山東泰安人，碩士，主要從事茶葉品質(zhì)化學(xué)、茶資源綜合利用及茶葉加工與審評(píng)的研究。

*通訊作者：teatesting@sina.com,shuygong@zju.edu.cn

中國茶葉加工2013，（3）:28～32