田力，田曉曄，于鑫琛，于洋，王瑞新，巴林

(沈陽醫(yī)學(xué)院臨床教研室，遼寧 沈陽 110034)

中藥的臨床運(yùn)用多以復(fù)方的形式出現(xiàn)，遵循君臣佐使的配伍規(guī)律，以中醫(yī)辨證論治為指導(dǎo)原則，具備功效的多向性和適應(yīng)證的廣泛性，能夠起到調(diào)理、調(diào)節(jié)、調(diào)攝等綜合作用，符合現(xiàn)代藥物學(xué)對(duì)多成分藥物的認(rèn)識(shí)，復(fù)方是中藥新藥開發(fā)的主要對(duì)象，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究是中藥研究的重要組成部分[1，2]。

抗粘靈氣霧劑由白芨、黃芪、赤芍、當(dāng)歸等8味中藥材組成，用于預(yù)防腹腔術(shù)后粘連，效果確切、方法簡(jiǎn)便易行，為臨床外科領(lǐng)域術(shù)中抗粘連有效藥物。為了保障臨床用藥安全有效，抗粘靈氣霧劑的質(zhì)量控制顯得尤為重要[3-8]。本文首次對(duì)抗粘靈氣霧劑處方中當(dāng)歸、赤芍等主要藥材進(jìn)行了TLC法鑒別，選擇阿魏酸、芍藥苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)法進(jìn)行定量測(cè)定，比較全面地對(duì)抗粘靈氣霧劑的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究[9，10]。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent1100紫外檢測(cè)器(美國Agilent公司)；BS110 型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；TG332A型微量分析天平(上海儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市新航儀器廠)；ZF-1三用紫外線分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

阿魏酸、黃芪甲苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；白芨、黃芪、赤芍、當(dāng)歸、燈盞花、大黃(沈陽天益堂大藥房)。

甲醇、石油醚、乙醇、環(huán)己烷、正丁醇、氯仿(分析純，天津康科德科技有限公司)；乙酸乙酯、濃硫酸、鹽酸、甲酸(分析純，沈陽化學(xué)試劑廠)；冰醋酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；香草醛(分析純，沈陽試劑三廠)；二硝基苯肼(分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠所屬試劑三廠)；硅膠G(化學(xué)純，青島海洋化工有限公司)；羧甲基纖維素鈉(沈陽化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸的薄層鑒別

2.1.1 阿魏酸對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成1.0 mg/ml的溶液，備用。

2.1.2 樣品液的制備 按處方比例取當(dāng)歸藥材及全方，精密稱定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸發(fā)皿中，濃縮至干，取干膏粉末適量，加水1.0 ml，超聲振蕩使其溶解，制成相當(dāng)于每1 ml中含1.0 g藥材的溶液，離心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.1.3 陰性液的制備 精密稱取除當(dāng)歸外的其他七味藥材，按照“2.1.2”項(xiàng)下制備。

2.1.4 薄層色譜條件 薄層板：硅膠G自制板(按《中國藥典》2010年版一部附錄VIB項(xiàng)下方法制備)；點(diǎn)樣：對(duì)照品溶液點(diǎn)樣2 μl，樣品液點(diǎn)樣2 μl；展開劑系統(tǒng)：環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)；展開方式：在展開槽中加入展開劑，預(yù)平衡15 min后，上行展開；顯色：365 nm紫外燈下觀察；斑點(diǎn)檢視：當(dāng)歸藥材，樣品液在與阿魏酸相應(yīng)的位置上出現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液中無相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.2 赤芍的薄層鑒別

2.2.1 芍藥苷對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成1.0 mg/ml的溶液，備用。

2.2.2 樣品液的制備 按處方比例取赤芍藥材及全方，精密稱定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸發(fā)皿中，濃縮至干，取干膏粉末適量，加水1.0 ml，超聲振蕩使其溶解，制成相當(dāng)于每1 ml中含1.0 g藥材的溶液，離心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.2.3 陰性液的制備 精密稱取除赤芍外的其他七味藥材，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備。

2.2.4 薄層色譜條件 薄層板：硅膠G自制板(同“2.1.4”項(xiàng)下)；點(diǎn)樣：對(duì)照品溶液點(diǎn)樣2 μl，樣品液點(diǎn)樣2 μl；展開劑系統(tǒng)：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5)；展開方式：在展開槽中加入展開劑，預(yù)平衡15 min后，上行展開；顯色：5%香草醛硫酸溶液；斑點(diǎn)檢視：赤芍藥材，樣品液在與芍藥苷相應(yīng)的位置上出現(xiàn)相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液中無相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.3 黃芪的薄層鑒別

2.3.1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加乙醇制成1.0 μl/ml的溶液，備用。

2.3.2 樣品液的制備 按處方比例取黃芪藥材及全方，精密稱定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸發(fā)皿中，濃縮至干，取干膏粉末適量，加水1.0 ml，超聲振蕩使其溶解，制成相當(dāng)于每1 ml中含1.0 g藥材的溶液，離心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.3.3 陰性液的制備 精密稱取除黃芪外的其他七味藥材，按照“2.3.2”項(xiàng)下制備。

2.3.4 薄層色譜條件 薄層板：硅膠G自制板(同“2.1.4”項(xiàng)下)；點(diǎn)樣：對(duì)照品溶液點(diǎn)樣2 μl，樣品液點(diǎn)樣2 μl；展開劑系統(tǒng)：石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)；展開方式：在展開槽中加入展開劑，預(yù)平衡15 min后，上行展開；顯色：2，4-二硝基苯肼乙醇溶液；斑點(diǎn)檢視：黃芪藥材，樣品液在與黃芪甲苷相應(yīng)的位置上出現(xiàn)相同的橙紅色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液中無相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.4 阿魏酸、芍藥苷的同時(shí)含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-1.4%冰醋酸水溶液線性梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 冰醋酸水溶液線性梯度洗脫程序

2.4.2 供試品溶液的制備 按處方比例取白芨、黃芪、赤芍、當(dāng)歸、燈盞花、大黃藥材粉末適量，精密稱定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，置于蒸發(fā)皿中，低溫水浴濃縮至稠膏狀，烘箱烘干。干膏用甲醇定容至10 ml，精密量取2 ml樣品液于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。

2.4.3 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液，在“2.4.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算不低于3 000，按芍藥苷計(jì)算不低于2 000，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。拖尾因子均在0.95～1.05之間。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別稱取阿魏酸、芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成單組分對(duì)照品溶液，其中含阿魏酸0.051 mg/ml、芍藥苷0.500 mg/ml。分別精密量取各單組分對(duì)照品溶液適量置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。阿魏酸、芍藥苷分別在2.04～20.4 μg/ml、32～400 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。所得回歸曲線方程阿魏酸y=36.521x-0.0485，r=0.9992；芍藥苷y=0.5861x-3.2088，r=0.9993。

2.4.5 重復(fù)性 按處方比例精密稱取各藥材進(jìn)行提取，共5份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，在“2.4.1”色譜條件下測(cè)定，阿魏酸、芍藥苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%、1.3%。

2.4.6 儀器精密度 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，阿魏酸、芍藥苷的RSD分別為0.9%、1.2%。

2.4.7 回收率試驗(yàn) 按處方比例精密稱取各藥材，共9份，精密加入一定量對(duì)照品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，在“2.4.1”色譜條件下測(cè)定，計(jì)算平均回收率。阿魏酸平均回收率為96.2%，RSD為1.5%；芍藥苷平均回收率為97.3%，RSD為1.0%。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液室溫下放置，分別于0、2、4、8、12和24 h在“2.4.1”色譜條件下測(cè)定。結(jié)果表明，阿魏酸、芍藥苷均在24 h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD分別為0.7%、1.9%。

2.4.9 樣品測(cè)定 按處方比例取各藥材粉末共5份，精密稱定，同“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，在“2.4.1”色譜條件下進(jìn)樣，阿魏酸的平均含量為0.374 mg/g，芍藥苷的平均含量為3.752 mg/g。

3 討論

3.1 TLC的選擇 參照《中國藥典》2010年版中相關(guān)藥材的薄層鑒別方法，本研究建立了抗粘靈氣霧劑中當(dāng)歸、赤芍、黃芪的薄層鑒別方法。當(dāng)歸的鑒別采用環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶ 0.1)為展開劑，在硅膠G板上展開；赤芍的鑒別采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5)為展開劑，顯色劑5%香草醛硫酸溶液，在硅膠G板上展開；黃芪的鑒別采用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，顯色劑為2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，在硅膠G板上展開。斑點(diǎn)分離較好，結(jié)果較為理想。

3.2 HPLC 本研究采用反相HPLC，同時(shí)測(cè)定了抗粘靈氣霧劑中阿魏酸、芍藥苷的含量，以乙腈-1.4%冰醋酸水溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，在275 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：阿魏酸在2.04～20.4 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9992，平均回收率為96.2%，RSD為1.5%；芍藥苷在32～400 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9993，平均回收率為97.3%，RSD為1.0%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)抗粘靈氣霧劑質(zhì)量提供了一個(gè)定量依據(jù)。

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