趙宏，趙化冰，曲鵬，李宗夢(mèng)，李君文

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；3.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)與環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常棲居菌。通常情況下，大腸桿菌對(duì)人類是無致病性的。但是某些情況下，大腸桿菌中的致病性菌株侵入人體一些部位時(shí)，就會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。

近些年由致病性大腸桿菌導(dǎo)致的全球食品污染事件頻發(fā)，從人們熟知的、肆虐全球20 年的大腸桿菌O157 ∶H7 以及去年于德國(guó)爆發(fā)的大腸桿菌O104 ∶H4均對(duì)人類健康以及經(jīng)濟(jì)貿(mào)易造成了重大損失。盡管人們已經(jīng)研發(fā)出了多種針對(duì)致病性大腸桿菌某些血清型的快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，使得目標(biāo)菌在較短時(shí)間內(nèi)被準(zhǔn)確檢出。但是在致病微生物的溯源領(lǐng)域仍然缺乏有效技術(shù)。剛剛過去的德國(guó)大腸桿菌疫情讓世界認(rèn)識(shí)到了有效的追溯體系對(duì)于避免大腸桿菌疫情再次上演至關(guān)重要。因此建立有效的微生物追溯方法、簡(jiǎn)便高效的追溯技術(shù)將改變公共衛(wèi)生突發(fā)事件的處置模式，極大提高工作效率。

因此，國(guó)內(nèi)外的科研工作者試圖用各種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)包括致病性大腸桿菌在內(nèi)細(xì)菌溯源問題，取得了一定的進(jìn)展。本文對(duì)于細(xì)菌溯源技術(shù)及在大腸桿菌研究中的進(jìn)展進(jìn)行了介紹。

“微生物溯源”一詞最先由Hagedorn 和Wiggins 提出。微生物溯源是指通過比較污染樣品和可能污染源中的微生物的差異或其他生物標(biāo)記的有無來判斷兩者之間的聯(lián)系，進(jìn)而確定污染來源[1-3]。

目前，人們對(duì)于檢測(cè)比較污染樣品和可能污染源中的微生物差異的方法主要可以分為兩類：生物化學(xué)方法（即表型方法）和分子方法。

生物化學(xué)方法（即表型方法）是以微生物基因產(chǎn)物——各種酶的生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，來判定微生物種類。常用的生物化學(xué)方法包括抗生素耐藥性分析法（antibiotic resistance analysis）和碳源利用法（carbon source utilization）。這兩種方法在實(shí)際檢測(cè)時(shí)都需要對(duì)大腸桿菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)并建立數(shù)據(jù)庫才能完成細(xì)菌源的追蹤分析。分子方法是基于細(xì)菌的遺傳物質(zhì)即DNA 為研究對(duì)象的。通過建立細(xì)菌個(gè)體的“DNA 指紋”，將分離于污染物的細(xì)菌樣本與可能的污染來源分離得到同類細(xì)菌樣本DNA 指紋進(jìn)行比對(duì)分析，從而得到污染來源。生化方法花費(fèi)低，操作簡(jiǎn)單，不依賴于大型分析儀器、適合日常大批量樣本分析的特點(diǎn)使之在基層應(yīng)用比較普及。但從本質(zhì)說，生物化學(xué)方法是基于細(xì)菌表型的鑒定方法，其結(jié)果容易因菌體生活狀態(tài)及培養(yǎng)條件的改變而產(chǎn)生變化，鑒定結(jié)果不夠穩(wěn)定，這是生化方法的不足；分子方法是基于細(xì)菌的遺傳物質(zhì)的差異，是通過分析菌株特定的基因位點(diǎn)或染色體組的多態(tài)性差異鑒定菌株種類，因此更加可靠穩(wěn)定，更加適合細(xì)菌溯源研究。

目前主要的細(xì)菌溯源的分子方法主要包括：脈沖場(chǎng)凝膠電泳法（PFGE）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ERIC-PCR）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、細(xì)菌的核糖體基因分型（ribotyping）、多位點(diǎn)序列分析（MLST）等。

1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）

1984 年，Schwartz 和Cantor 首先提出了脈沖電泳法，原理是將經(jīng)過凝膠的連續(xù)電場(chǎng)改為脈沖電場(chǎng)，這就使百萬兆基大小的DNA 片段以特定的大小尺寸進(jìn)行分離，同時(shí)使得片段的分析精確性更高?，F(xiàn)已證實(shí)PFGE 方法的鑒別能力相當(dāng)高，在大腸桿菌的研究領(lǐng)域中占有很大優(yōu)勢(shì)。PFGE 現(xiàn)在被廣泛用于致病微生物的分型[4]，被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。目前，美國(guó)FDA 已經(jīng)建成了基于PFGE 的致病微生物檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)，即PulseNet。美國(guó)PulseNet 網(wǎng)絡(luò)依托各地州監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室，通過分離的病原細(xì)菌DNA“指紋圖譜”分析（主要利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)）以及網(wǎng)絡(luò)化信息交流平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)傳染病的跨地區(qū)和國(guó)際間傳播，開展傳染病暴發(fā)流行的調(diào)查、追蹤、溯源，已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)、處置和預(yù)警了多起食源性傳染病暴發(fā)疫情。目前國(guó)際PulseNet 已經(jīng)拓展到眾多區(qū)域，組成了包括加拿大PulseNet、歐洲PulseNet、亞太區(qū)PulseNet、拉丁美洲PulseNet、中亞PulseNet 在內(nèi)的國(guó)際化網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)也已經(jīng)成為世界衛(wèi)生組織以及國(guó)際公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)獲取信息和應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生事件的重要依據(jù)。國(guó)際PulseNet 涉及的傳染病病原體包括產(chǎn)毒性大腸桿菌O157、沙門菌、單增李斯特菌、志賀菌、彎曲桿菌、霍亂弧菌等。

理論上，所有的細(xì)菌都能通過PFGE 進(jìn)行分型分類。PFGE 在細(xì)菌溯源研究中的應(yīng)用是基于菌株的DNA 指紋原理來確定菌株之間的親緣關(guān)系。在食源性病原體溯源研究中，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理，依據(jù)Tenover 等（1995）[6]提出的有關(guān)菌株同源性判別標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株之間的相關(guān)性，對(duì)協(xié)助追蹤感染來源起到了重要作用。Bono JL，Smith TP 等對(duì)于STEC O157 的來源進(jìn)行研究，利用PFGE 對(duì)426 個(gè)分離株進(jìn)行分析，結(jié)果揭示了STEC O157 存在762 個(gè)基因組多態(tài)性，可分成175 個(gè)型。該研究發(fā)現(xiàn)在8 個(gè)主要STEC O157 譜系中，有7 個(gè)來源于牛，揭示了PFGE 對(duì)于流病菌株內(nèi)部親近菌株的進(jìn)化關(guān)系分析具有優(yōu)勢(shì)[7]。

2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）

RFLP 是最早被使用的分子標(biāo)記技術(shù)，它反映了DNA 分子不同酶切位點(diǎn)的分布情況。其原理是DNA序列堿基的改變能夠引起限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的產(chǎn)生或消失，限制性內(nèi)切酶對(duì)不同個(gè)體的DNA 序列處理后所產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度不同，通過凝膠電泳區(qū)分出不同的條帶，與DNA 探針進(jìn)行Southern 雜交和放射自顯影后便可獲得能反映出個(gè)體特性的RFLP 圖譜。RFLP 標(biāo)記不受標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目的限制，共顯性好，結(jié)果很穩(wěn)定，適合用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。Ho PL，Lo WU 等利用對(duì)大腸桿菌中CTX-M 編碼質(zhì)粒進(jìn)行包括RFLP 在內(nèi)的分析，以鑒定分離株是來源于動(dòng)物糞便、人糞或人尿中，研究表明在IncFII group 的大腸桿菌菌株的CTX-M-14 編碼質(zhì)粒具有不同的來源[8]。

3 腸桿菌基因間重復(fù)一致序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）

ERIC（enterobacterial repetitive intergenic consensus）是Sharples 等首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種腸桿菌基因間共有重復(fù)序列[9]。其中心存在高度保守的、長(zhǎng)約44 bp 的核心序列。不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，可進(jìn)行指紋圖譜分析。原理是利用根據(jù)ERIC 核心序列設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在50 bp～3 000 bp 之間，根據(jù)所得數(shù)目不等、大小不同的各自獨(dú)特的電泳帶型來達(dá)到菌株分型的目的。ERIC-PCR 技術(shù)不僅可以用于含ERIC 序列的細(xì)菌的分類與鑒定還可進(jìn)行菌株親緣關(guān)系鑒定等研究[10-15]。DuanH，ChaiT 等利用ERIC-PCR 對(duì)于豬舍氣溶膠中的大腸桿菌來源進(jìn)行分析。他分別對(duì)豬舍舍內(nèi)、上風(fēng)處及下風(fēng)處等6 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行菌株收集。實(shí)驗(yàn)證明35.1%的氣溶膠大腸桿菌來源于豬的糞便[16]。

4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP 是由1992 年荷蘭科學(xué)家Zabeau 和Vos 所創(chuàng)造[17]，其原理是將RFLP 和RAPD 相結(jié)合，用內(nèi)切酶切割基因組DNA 獲得不同長(zhǎng)度的片段，用特定的接頭使這些DNA 片段的兩端連接，形成一個(gè)帶接頭的特異片段，通過接頭序列和PCR 引物3′末端的識(shí)別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最后通過聚丙烯酰胺電泳使這些特異的限制性片段分離。AFLP 結(jié)合了RFLP 和RAPD 兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，使標(biāo)記方法既具有RFLP 的可靠性，又具有RAPD 的靈敏性。此方法操作簡(jiǎn)單、成本較低、省去了制備探針和分子雜交的過程、多態(tài)信息含量豐富，是目前一種有效的分子標(biāo)記。AFLP 是第一代分子標(biāo)記，在基因定位、連鎖圖譜的構(gòu)建等方面應(yīng)用較多。目前AFLP 在大腸桿菌來源追溯上的應(yīng)用研究較少，查到的有Leung KT，Mackereth R 等利用AFLP 技術(shù)對(duì)110株不同寄主來源的大腸桿菌分離株進(jìn)行溯源與致病力的研究，發(fā)現(xiàn)AFLP 在檢測(cè)大腸桿菌寄主來源及致病性方面具有很高效率。對(duì)寄主識(shí)別率在90%以上，對(duì)于非致病大腸桿菌與腸致病性，VT 細(xì)胞毒素型的區(qū)分率也在90%以上[18]。Guan S，Xu R，Chen S 等也利用AFLP 對(duì)105 株不同來源的寄主糞便中分離得到的大腸桿菌進(jìn)行來源追溯，發(fā)現(xiàn)94%牲畜分離株，97%野生動(dòng)物分離株，97% 人分離株被準(zhǔn)確追溯，AFLP 與multiple-antibiotic-resistance（MAR）和16SrRNA 相比，具有更高效率[19]。

5 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）

SNP 是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，它是指基因組上的單個(gè)核苷酸發(fā)生變異而引起的多態(tài)性，SNP 所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP 并不包括后兩種情況。轉(zhuǎn)換和顛換的比例大概為2 ∶1。SNP是二等位基因多態(tài)，也叫做雙等位基因標(biāo)記（biallelic marker），有時(shí)也會(huì)有3 個(gè)和4 個(gè)等位基因多態(tài)性存在，但這很罕見。由于二等位多態(tài)性是非此即彼的選擇，往往只分析＋/－即可，有利于進(jìn)行基因分型和自動(dòng)化篩選[20]。SNP 分布十分廣泛，幾乎在所有的已知或未知基因附近都能找到一系列的標(biāo)記位點(diǎn)[21-22]，在人體中，每一千個(gè)堿基當(dāng)中就會(huì)發(fā)生一個(gè)SNP[23]，而在其他的哺乳類動(dòng)物的基因組中也很可能含有兩到三百萬個(gè)SNP。早期研究證實(shí)，在獲得更加豐富的SNPs 基礎(chǔ)上可以大大增加對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分型的能力。因此大腸桿菌SNPs 位點(diǎn)研究逐漸成為熱點(diǎn)。2005 年，F(xiàn)lorence Hommais 利用MLST 技術(shù)研究大腸桿菌SNP位點(diǎn)以及基于SNPs 的進(jìn)化關(guān)系[24]。2006 年，張唯等利用STEC O157：H7 全基因組測(cè)序芯片篩查獲得了可觀的SNPs，在523 染色體組基因中共發(fā)現(xiàn)906 個(gè)不同的SNPs。由此并制作了STEC O157：H7 染色體SNP 結(jié)構(gòu)圖，進(jìn)而以此對(duì)STEC O157：H7 的起源做了研究[25]。

因此SNP 所獨(dú)有的數(shù)量多、分布廣泛、適于快速、規(guī)模化篩查、易于基因分型的特性決定了它更適合于對(duì)細(xì)菌不同地域性進(jìn)行溯源識(shí)別，在食品安全相關(guān)的細(xì)菌溯源研究具有巨大潛力。本課題組對(duì)多個(gè)國(guó)家進(jìn)口的食品中大腸桿菌分離株進(jìn)行了基于持家基因SNP研究，發(fā)現(xiàn)了適于溯源的特異性地理標(biāo)記，顯示了SNP技術(shù)具備地理溯源能力。

6 細(xì)菌的核糖體基因分型（ribotyping）

核糖體分型技術(shù)是RFLP-Southern 印記技術(shù)的一種，所使用的探針是根據(jù)16S 和23SrRNA 序列設(shè)計(jì)，大大減少了雜交后圖譜所包含條帶的數(shù)量，非常易于分析。但是這一特點(diǎn)也限制了這一技術(shù)應(yīng)用于相關(guān)性較近的菌株間的鑒別。

核糖體分型利用細(xì)菌核糖體RNA 都含有高度保守的“持家基因”特性，核糖體RNA 基因存在于所有細(xì)菌中并且在遺傳上高度保守，所有細(xì)菌在染色體不同位點(diǎn)上都有多個(gè)核糖體基因操縱子，針對(duì)該保守序列設(shè)計(jì)探針，與之雜交，可以觀察核糖體RNA 基因在整個(gè)基因組分布的多態(tài)性。具體方法是將基因組DNA 進(jìn)行酶切消化并用電泳進(jìn)行分離，然后采用針對(duì)核糖體持家基因設(shè)計(jì)的特異性探針進(jìn)行雜交，記錄探針的雜交狀況，從而得到核糖體RNA 基因分布圖。美國(guó)Dupont 公司全自動(dòng)微生物核糖體基因分型系統(tǒng)（RiboPrinter microbial characterization system）的推出，使得RT 分型方法實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，這是其在分子分型中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。利用這套系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行核糖體分型，可在8 h 內(nèi)獲得結(jié)果，該方法可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量致病菌進(jìn)行分析，結(jié)果重復(fù)性較高。Wu J，Rees P，Dorner S.對(duì)于Blackstone River 分水嶺上部的大腸桿菌的密度以及來源通過ribotyping 進(jìn)行研究。對(duì)于大腸桿菌來源的研究結(jié)果分析，利用ribotyping 可以確定在居住區(qū)大部分大腸桿菌來源于人，而在開闊地和叢林則主要來源于野生動(dòng)物[26]。

7 多位點(diǎn)序列分析（Multilocussequencetyping，MLST）

多位點(diǎn)測(cè)序分型（MLST）技術(shù)是近些年才發(fā)展起來的分子生物學(xué)分析方法，它結(jié)合了高通量的序列測(cè)定和生物信息學(xué)的方法，具有較高的分辨率。它針對(duì)持家基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，根據(jù)得出的每株病原體各個(gè)座位等位基因數(shù)目進(jìn)行等位基因圖譜或序列類型鑒定以及聚類分析。該技術(shù)快速簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，分辨率較高，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)共享及比較[27]。該技術(shù)被用于許多致病微生物的進(jìn)化研究。Andrew R.Dodgson 等應(yīng)用MIST 方法對(duì)不同地理區(qū)域收集的107 株臨床光滑念珠菌菌株及2 個(gè)參考菌株進(jìn)行指紋圖譜分析，對(duì)11 個(gè)持家基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序分析，其中有6 個(gè)基因的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性位點(diǎn)，81 個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有變異。在109 株菌中鑒定出了30 個(gè)序列型（STs），在所有分離株中有5 個(gè)主要的分支，其中3 個(gè)進(jìn)化分支顯示明顯的地理差異，表明在不同的地理區(qū)域，光滑念珠菌具有明顯的遺傳分化[28]。

Maxim S.Sheludchenko，F(xiàn)lavia Huygens 通過MLST數(shù)據(jù)庫分析，運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件根據(jù)大腸桿菌MLST 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，確定以大腸桿菌6 個(gè)管家基因中的8 個(gè)高分辨率的SNP 位點(diǎn)組合為標(biāo)記，使用等位基因特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)（AS-qPCR）對(duì)于澳大利亞昆士蘭東南地區(qū)環(huán)境糞便樣本分離得到的114 株大腸桿菌進(jìn)行溯源分析。結(jié)果將114 株大腸桿菌劃分為50 個(gè)不同的SNP profiles，并且還發(fā)現(xiàn)了一些寄主特異性的SNP profiles，這其中就包括人源特異的SNP profiles[29]。這在該課題組隨后的研究中利用6個(gè)人源SNP profiles 對(duì)昆士蘭東南地區(qū)Coomera River 進(jìn)行了為期2 年的研究。證明了人源特有的SNPprofiles 存在，并以此做了人為活動(dòng)對(duì)水源的影響研究[30]。但該技術(shù)在管家基因不存在或僅存在低水平變異的病原株中分辨率較低，而且系統(tǒng)進(jìn)化樹圖不一定能反映其間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

綜上所述，在大腸桿菌溯源研究中多種分子生物學(xué)技術(shù)和方法都被嘗試應(yīng)用。這些技術(shù)各有優(yōu)劣，運(yùn)用得當(dāng)會(huì)在食品安全監(jiān)管、公共衛(wèi)生、疾病預(yù)防以及口岸健康監(jiān)控、食品安全等領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)有作用。上述技術(shù)也許還不能完全概括現(xiàn)今研究的全部，但是筆者認(rèn)為這些技術(shù)可能在未來的細(xì)菌溯源研究領(lǐng)域中繼續(xù)使用，尤其是在致病性大腸桿菌追溯體系中占有一席之地，只是所占比例有所不同。在這些技術(shù)中，SNP及MLST 技術(shù)將是未來主要方向。受到人類基因組計(jì)劃的推動(dòng)，人類對(duì)于大腸桿菌基因組結(jié)構(gòu)及功能已經(jīng)清晰掌握，并可能運(yùn)用強(qiáng)大的生物信息學(xué)手段找到適合各種溯源要求的標(biāo)記。SNP 的另一個(gè)迷人之處在于它的檢測(cè)易于自動(dòng)化、高通量，所以一旦發(fā)現(xiàn)可用于溯源的標(biāo)記，大腸桿菌的溯源就變得簡(jiǎn)單易行了。同時(shí)，SNP 技術(shù)結(jié)合了MLST 的開放數(shù)據(jù)平臺(tái)，借助eBURST 分析可以為研究大腸桿菌群體遺傳關(guān)系，分析大腸桿菌地域間遺傳多樣性提供強(qiáng)大支持。因此，我們相信日新月異的分子生物學(xué)技術(shù)必然會(huì)促進(jìn)大腸桿菌溯源技術(shù)的不斷進(jìn)步，使大腸桿菌的行蹤在人類掌握之下，從而使人類能更好地預(yù)防因致病性大腸桿菌導(dǎo)致的食源性疾病。

[1]Meays CL,Broersma K,Nordin R,et al.Source tracking fecal bacteria in water：A critical review of current methods[J].Journal of environmental management,2004,73(1)：71-79

[2]Scott T M,Rose J B,Jenkins T M,et al.Microbial source tracking：Current methodology and future directions[J].Applied and environmental microbiology,2002,68(12)：5796-5803

[3]Carson C A,Shear B L,Ellersieck M R,et al.Comparison of ribotyping and repetitive extragenic palindromic PCR for identification of fecal Escherichia coli from humans and animals[J].Applied and environmental microbiology,2003,69(3)：1836-1839

[4]Myoda S P,Carson C A,Fuhrmann J J,et al.Comparison of genotypic based microbial source tracking methods requiring a host origin database[J].Journal of water and health,2003,1(4)：167-180

[5]邱少富,端青.類鼻疽伯克霍爾德菌基因分型技術(shù)研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2009,33(2)：176-178

[6]Tenover F C,Arbeit R D,Goering R C,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed field gel electrophoresis：criteria for bacterial strains typing[J].J Clin Microbiol,1995,33(9)：2233-2239

[7]Bono J L,Smith T P,Keen J E,et al .Phylogeny of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O157 isolated from cattle and clinically Ill Humans[J].Mol Biol Evol,2012,29(8)：2047-2062

[8]Ho PL,Lo WU,Yeung MK,et al.Dissemination of pHK01-like incompatibility group IncFII plasmids encoding CTX-M-14 in Escherichia coli from human and animal sources[J].Vet Microbiol,2012,158(1/2)：172-179

[9]SHARPLES G J,LOYD R G.A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes[J].Nucleic acids research,1990,18(22)：6503-6508

[10]林朝紅,倪學(xué)勤,曾東,等.重復(fù)序列ERIC(IRU)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(2)：370-373

[11]VERSALOVIC J,KOEUTH T,LUPSKI J R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacteria genomes[J].Nucleic acids research,1991,19(24)：6823-6831

[12]劉佳妍,金莉莉,王秋雨.細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR 技術(shù)及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(3)：90-93

[13]JurkovicˇD,Krizˇková L,Sojka M,et al.Genetic diversity of Enterococcus faecium isolated from Bryndza cheese[J].Int J Food Microbiol,2007,116(1)：82-87

[14]Hulton C S,Higgins C F,Sharp P M.ERIC sequences：a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli,Salmonella typhimuirum and other enterobacteria[J].Mol Microbiol,1991,5(4)：825-834

[15]McCartney A L,Wenzhi W,Tanock G W.Molecular analysis of the composition of the bifidobacterial and lactobacillus microflora of humans[J].Appl environ microbiol,1996,62(12)：4608-4613

[16]Duan H,Chai T,Liu J,et al.Source identification of airborne Escherichia coli of swine house surroundings using ERIC-PCR and REP-PCR[J].Environ Res,2009,109(5)：511-517

[17]Velappam N,Sondgrass J L,Hakovirta J R.Rapid identification of pathogenic bacteria by single-enzyme amplified fragmem length polymorplfism analysis[J].Diagnostic microbiology and infections disease,2001,39(2)：77-83

[18]Leung K T,Mackereth R,Tien Y C,et al.A comparison of AFLP and ERIC-PCR analyses for discriminating Escherichia coli from cattle,pig and human sources[J].FEMS Microbiol Ecol,2004,47(1)：111-119

[19]Guan S,Xu R,Chen S,et al.Development of a procedure for discriminating among Escherichia coli isolates from animal and human sources[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(6)：2690-2698

[20]吳昕彥,張慶華,陳竺.單核苷酸多態(tài)性研究及應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2000,17(1)：57-59

[21]王淑新,連林生.單核苷酸多態(tài)性作為新一代分子標(biāo)記的優(yōu)越性[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2008,35(4)：31-33

[22]Sachidanandam R,Weissman D,Schmidt S C,et al.The International SNP Map Working Group.A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms[J].Nature,2001,409(6822)：928-933

[23]COOPER D N,SMITH B A,COOKE H J.An estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome[J].Human genetics,1985,69(3)：201-205

[24]Hommais F,Pereira S,Acquaviva C,et al.Single-nucleotide polymorphism phylotyping of Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(8)：4784-4792

[25]Zhang Wei,Qi Weihong,Thomas J Albert.Probing genomic diversity and evolution of Escherichia coli O157 by single nucleotide polymorphisms[J].Genome Res,2006,16(6)：757-767

[26]Wu J,Rees P,Dorner S.Variability of E.coli density and sources in an urban watershed[J].J Water Health,2011,9(1)：94-106

[27]Maiden MCJ.Multilocus sequence typing：a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(6)：3140-3145

[28]Andrew R Dodgson,Claude Pujol.Multilocus sequence typing of Candida glabrata reveals geographically enriched clades[J].J Clin Microbiol,2003,41(12)：5709-5717

[29]Sheludchenko MS,Huygens F,Hargreaves MH.Highly discriminatory single-nucleotide polymorphism interrogation of Escherichia coli by use of allele-specific real-time PCR and eBURST analysis[J].Appl environ microbiol,2010,76(13)：4337-4345

[30]Sheludchenko MS,Huygens F,Hargreaves MH.Human-specific E.coli single nucleotide polymorphism (SNP)genotypes detected in a South East Queensland waterway[J].Australia：Environ Sci Technol,2011,45(24)：10331-10336