李思思，王 濤，董志紅，和琳琳，高藝歌

(1.河南省康利醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司 河南鄭州 450044;2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 河北邯鄲 056002;3.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院 河北邯鄲 056002;4.鄭州圣華藥物食品技術(shù)開發(fā)有限公司 河南 鄭州 450044)

檸檬烯是一種天然的功能性單萜化合物，廣泛地存在于很多具有芳香性的植物中，是分布最廣的萜烯類化合物。檸檬烯具有三種空間異構(gòu)體，分別是右旋檸檬烯、消旋檸檬烯、左旋檸檬烯，其中右旋檸檬烯不僅是自然界中存量最多的，也是被廣泛應(yīng)用和藥理活性最突出的。

1 右旋檸檬烯的用途

右旋檸檬烯多年來常作為香料用于食品添加劑、天然洗滌劑、驅(qū)蟲劑以及在油漆中作為溶劑［1-2］。也可作為原料制備成1，2環(huán)氧化物［3］、1－甲基－4－乙?；?－環(huán)己烯［4］等基礎(chǔ)化學(xué)中間體物質(zhì)。醫(yī)藥領(lǐng)域中，檸檬烯在臨床上被用來作為治療膽囊炎的藥物已在我國批準(zhǔn)上市。另外右旋檸檬烯還具有鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)［3］、抑制胃食管反流和促進(jìn)胃腸健康蠕動、溶解膽結(jié)石、緩解心絞痛［5］、抗菌［6］等作用。

2 右旋檸檬烯的抗腫瘤活性

近年來，許多研究者對右旋檸檬烯在臨床上的抗腫瘤活性進(jìn)行了深入地研究，現(xiàn)將研究進(jìn)展總結(jié)如下。

Jia S S等［7］研究了體外右旋檸檬烯對結(jié)腸癌細(xì)胞生存能力的作用以及它潛在的行為機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)右旋檸檬烯以劑量依賴性的方式活化caspase-3和-9(半胱天冬酶-3和9)和多聚ADP-核糖聚合酶的分裂，以劑量依賴性的方式抑制LS174T細(xì)胞的生存能力，并且引起劑量依賴性的細(xì)胞凋亡。

Chidambara Murthy K N等［8］從血橙中獲得的主要成分是右旋檸檬烯的揮發(fā)油，將其制成乳劑，并檢查它對結(jié)腸癌細(xì)胞生存能力的影響。研究結(jié)果顯示其對結(jié)腸癌細(xì)胞有劑量－依賴性抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡作用，可能在預(yù)防癌癥上具有巨大的潛力。Jamia Hamdard 等［9］研究了右旋檸檬烯對于由7，12-二甲基苯蒽(DMBA)-發(fā)起的以及12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)-促進(jìn)的皮膚腫瘤發(fā)展的作用。他們發(fā)現(xiàn)右旋檸檬烯對小鼠皮膚的治療明顯地減少TPA-誘導(dǎo)的①水腫和增生(P＜0.01);②環(huán)氧合酶-2的表達(dá);③鳥氧酸脫羧酶的活性(P＜0.01);④［(3)H］胸腺嘧啶脫氧核苷合并入DNA(P＜0.01)。在二期皮膚腫瘤研究中，與DMBA/TPA-處理過的鼠相比較，右旋檸檬烯顯著地減少了腫瘤負(fù)擔(dān)(P＜0.05)和腫瘤發(fā)生率。Thangaiyan Rabi等［10］探索著去定性是否非毒性劑量的右旋檸檬烯可以提高轉(zhuǎn)移性前列腺癌的體外模型中腫瘤對紫杉萜的響應(yīng)。研究結(jié)果顯示，右旋檸檬烯提高紫杉萜抗前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，對正常的前列腺上皮細(xì)胞沒有毒性。右旋檸檬烯能夠用來做為一種潛在的無毒劑來提高用紫杉萜對于激素非依賴性前列腺癌的治療效果。

徐耀庭等［11］探討了右旋檸檬烯對人膀胱癌EJ細(xì)胞生長和ras p21表達(dá)的影響。研究結(jié)論認(rèn)為，右旋檸檬烯對EJ細(xì)胞生長具有明顯的細(xì)胞毒作用，并呈一定的量效關(guān)系。徐耀庭等［12］于2010年再次發(fā)表文章論述道，右旋檸檬烯對人膀胱癌EJ細(xì)胞具有顯著的抑制作用，它還能使EJ細(xì)胞停滯于S期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。楊真等［13］的研究結(jié)果證明右旋檸檬烯能夠誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡，線粒體凋亡的激活可能是凋亡誘導(dǎo)的主要機(jī)制。王金香等［14］的研究發(fā)現(xiàn)右旋檸檬烯可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的蓄積，線粒體膜電位(MMP)的下降和Caspase-8活化。右旋檸檬烯誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡機(jī)制是通過活性氧非依賴的Caspase-8活化來實現(xiàn)的。王玲等［15］的研究結(jié)果顯示，右旋檸檬烯可以引起MGC803細(xì)胞凋亡，且呈時間依賴性。發(fā)現(xiàn)右旋檸檬烯處理的細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高(P＜0.05)，caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。她們認(rèn)為，右旋檸檬烯能有效地抑制癌細(xì)胞的生長以及誘導(dǎo)凋亡。

右旋檸檬烯祛痰、止咳、平喘的作用機(jī)理也正在被逐步揭示。內(nèi)蒙古大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的Chi G等［16］進(jìn)行的研究顯示，右旋檸檬烯減少LPS-誘導(dǎo)的明顯肺組織病理學(xué)改變，肺濕－比－干的重量比率，以及肺綠過氧物酶的活性。另外，用檸檬烯預(yù)處理抑制BALF中的炎癥細(xì)胞和促炎因子包括腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素-1β、以及白細(xì)胞介素-6。結(jié)果表明，檸檬烯保護(hù)性的作用機(jī)制可能部分地歸因于通過抑制NF-κB和MAPK的活性而減少促炎因子的產(chǎn)生。

一篇綜述性文獻(xiàn)對右旋檸檬烯的抗癌作用有概括的表述［5］。動物研究已確定右旋檸檬烯對幾種類型的癌癥有化學(xué)保護(hù)活性的階段。實驗證實了在嚙齒類動物中服用橘皮或純的右旋檸檬烯能抑制化學(xué)誘導(dǎo)的乳腺癌。其它的動物實驗證明右旋檸檬烯能抑制肝癌、肺腺瘤、前胃腫瘤的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)右旋檸檬烯通過增加細(xì)胞凋亡，同時減少癌癥細(xì)胞的DNA合成和鳥氨酸脫羧酶的活性來減少胃癌。右旋檸檬烯通過抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以及阻塞致癌基因的表達(dá)抑制肝癌的形成。右旋檸檬烯也顯示出免疫調(diào)節(jié)的性質(zhì)。

3 討論

3.1 檸檬烯制劑存在的問題 綜上所述，右旋檸檬烯在臨床上，尤其是抗腫瘤的方面具有突出的作用。盡管目前我國只是把檸檬烯(混合體)作為治療膽囊炎的藥物批準(zhǔn)上市，但隨著右旋檸檬烯基礎(chǔ)研究的深入，更為廣泛的臨床應(yīng)用將會被不斷拓寬。要實現(xiàn)這個目標(biāo)，其中最重要的問題就是對現(xiàn)有檸檬烯制劑的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行提升。然而已經(jīng)獲得上市的檸檬烯口服制劑的產(chǎn)品質(zhì)量并不令人樂觀，主要存在以下2個問題。①檸檬烯原料沒有被規(guī)范地確定為右旋檸檬烯并且應(yīng)該具備相應(yīng)的高純度，被獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的是檸檬烯3種空間異構(gòu)體以及雜質(zhì)的混合物。根據(jù)我國頒布的檸檬烯原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［17］，含量確定為檸檬烯，沒有區(qū)分3種空間異構(gòu)體，且含量僅為80%。作為檸檬烯藥物制劑的檸檬烯膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［18］，由于受檸檬烯原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限制，其有效成分也僅以檸檬烯混合物確認(rèn)。②制劑的質(zhì)量不穩(wěn)定。目前我國被批準(zhǔn)上市的是檸檬烯膠囊，是采用沒有被純化的檸檬烯原料與淀粉的混合顆粒物填充到硬膠囊殼中。由于檸檬烯所具有的揮發(fā)性，這種藥物制劑在生產(chǎn)出來之后，隨著貯藏時間的延續(xù)和貯藏環(huán)境溫度的變化，混雜在淀粉顆粒被填充在硬膠囊中的檸檬烯一方面會被氧化，另一方面會揮發(fā)出來，使得制劑的質(zhì)量發(fā)生改變。

由于存在上述2種問題，不能從根本上保障檸檬烯制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，也就無法確保已經(jīng)批準(zhǔn)適應(yīng)癥(利膽藥)的有效治療，更無法給檸檬烯臨床擴(kuò)展應(yīng)用提供穩(wěn)定的藥物和制劑基礎(chǔ)。

3.2 檸檬烯的新型專利技術(shù) 筆者及與之合作的研究人員所申報的檸檬烯制劑的發(fā)明和實用新型工藝專利日前首先得到了國家知識產(chǎn)權(quán)局的實用新型專利授權(quán)，其發(fā)明專利正處于審查過程之中?，F(xiàn)將工藝專利的技術(shù)要點表述如下。

根據(jù)已有的上述研究文獻(xiàn)可知，右旋檸檬烯不僅具有揮發(fā)性，且容易被氧化。在大氣中，檸檬烯和其它的萜烯快速進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)生成羥基、硝酸自由基和臭氧。右旋檸檬烯暴露于空氣中形成的D-檸檬烯的氫過氧化物和其他的氧化產(chǎn)物已被證明是有效的接觸致敏原。而未氧化的D-檸檬烯沒有任何致敏作用。針對這個特點，該制備技術(shù)分兩個部分。①制備工藝的改變。該技術(shù)采用直接將檸檬烯液體灌裝在硬膠囊中的填充方式。同時對膠囊填充劑的填充部位進(jìn)行低溫和充氮保護(hù)，以避免檸檬烯在膠囊填充的過程中與空氣接觸而產(chǎn)生氧化降解。不僅可以在制備過程中防止檸檬烯的氧化確保填充到硬膠囊殼中檸檬烯的質(zhì)量，也可以保護(hù)生產(chǎn)工人不對氧化后的檸檬烯過敏，提高了生產(chǎn)的安全性。②對填充后的硬膠囊進(jìn)行包衣或?qū)δz囊接口處進(jìn)行膠帶封口密封以防止檸檬烯在貯藏的過程中揮發(fā)溢出而降低檸檬烯的含量。

按照上述工藝的基本原理可制備成檸檬烯硬膠囊劑。如果采用一般膠囊規(guī)格生產(chǎn)的這種制劑可以作為人用藥品取代目前的檸檬烯膠囊產(chǎn)品。如果采用00號膠囊殼或特制的內(nèi)容量更大一些的硬膠囊殼，則這種制劑可以作為一種便攜式清洗劑，用于小面積油污、墨跡、粘膠等的清洗，不僅方便，也安全。

［1］王德明，朱志良.三氯乙烯替代品-右旋檸檬烯的應(yīng)用研究［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，13(4):1032-1033.

［2］李小玉，陳靜靜.一種含D-檸檬烯的油墨清洗劑的研制［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2010，40(3):178-180.

［3］尹顯洪，楊仕平，楊滿芽.檸檬烯選擇性環(huán)氧化的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)試劑，1998，20(5):267-269.

［4］楊始剛，嵇金麗，戴瑩，等.從檸檬烯合成1-甲基-4-乙?；?1-環(huán)己烯的研究［J］.廣州化工，2009，37(3):118-119.

［5］Sun J.D-Limonene:Safety and Clinical Applications［J］.Altern Med Rev，2007，12(3):259-264.

［6］王雪梅，諶徽，李雪姣，等.天然活性單帖-檸檬烯的抑菌性能研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32(1):24-28.

［7］Jia S S，Xi G P，Zhang M，et al.Induction of apoptosis by D － limonene is mediated by inactivation of Akt in LS174T human colon cancer cells［J］.Oncol Rep，2013，29(1):349-354.

［8］Chidambara Murthy K N，Jayaprakasha G K，Patil B S.D－limonene rich volatile oil from blood oranges inhibits angiogenesis，metastasis and cell death in human colon cancer cells［J］.Life Sci，2012，91(11-12):429-439.

［9］Jamia H，Siddiqui M S，Athar M，et al.D－Limonene modulates inflammation，oxidative stress and Ras-ERK pathway to inhibit murine skin tumorigenesis［J］.Hum Exp Toxicol，2012，31(8):798-811.

［10］Rabi T，Bishayee A.D-Limonene sensitizes docetaxel－induced cytotoxicity in human prostate cancer cells:Generation of reactive oxygen species and induction of apoptosis［J］.J Carcinog，2009，8:1-9.

［11］徐耀庭，顧煒，劉江霞，等.D－檸檬烯對人膀胱癌細(xì)胞生長和ras p21表達(dá)的影響［J］.中華泌尿外科雜志，2008，29(12):808－810.

［12］徐耀庭，李勁松，顧煒，等.D－檸檬烯誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡的研究［J］.中國醫(yī)學(xué)工程，2010，18(3):6-9.

［13］楊真，紀(jì)軍，刁鳳聲.右旋檸檬烯誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的初步探討［J］.腫瘤，2008，28(11):938-941.

［14］王金香，張玉祥.D－檸檬烯誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.科技資訊，2010，(5):6-9.

［15］王玲，張秀珍.D－檸檬烯對人胃癌MGC803細(xì)胞株增殖和凋亡的影響［J］.生命科學(xué)儀器，2009，7(1):26-28.

［16］Chi G，Wei M，Xie X，et al.Suppression of MAPK and NF － κB pathways by limonene contributes to attenuation of lipopolysaccharideinduced inflammatory responses in acute lung injury［J］.Inflammation，2013，36(2):501-511.

［17］國家食品藥品監(jiān)督管理局.檸檬烯原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.WS-10001-(HD-0535)-2002.

［18］國家食品藥品監(jiān)督管理局.檸檬烯膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.WS-10001-(HD-0536)-2002.