彭蕓蕓 仲曉寧 李春蕾 （山東省煙臺市動物疫病預(yù)防與控制中心 264003）

豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病毒(PRV)引起的急性傳染病，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]?；蚬こ桃呙鐚υ摬〉念A(yù)防起到了十分重要的作用，通過基因工程技術(shù)使PRV中的毒力基因失活，但病毒粒子仍然保持較好的抗原性。重組病毒粒子作載體同目的基因一起在動物體內(nèi)表達(dá)不僅十分安全，還可以做到一針多防，提高生產(chǎn)效率，在新型動物病毒載體中已顯示出了良好的應(yīng)用前景。本文就偽狂犬病毒載體研究進(jìn)展作一綜述。

1 豬偽狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)

豬偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科中的豬皰疹病毒Ⅰ型。病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長度為150kb，C+G含量約為74%，由長獨(dú)特區(qū)(UL)和短獨(dú)特區(qū)(US)，以及US兩側(cè)的重復(fù)序列(TRS)與內(nèi)部重復(fù)序列(IRS)所組成。US和UL區(qū)段，含有至少70個基因，可編碼70～100種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子只含有約50種蛋白質(zhì)[2]。

在PRV中已發(fā)現(xiàn)11種糖蛋白，分別命名為gB(gⅡ)、gc(gⅢ)、gD(gp50)、gE、gG(gX)、gH、gI(gp63)、gK、gL、gM和gN，它們已被定位和測序[3]。病毒增殖的必需的糖蛋白主要有g(shù)B、gD、gH、gL、gK；非必需糖蛋白是決定毒力因素的因子，主要有g(shù)E、gI、gG、gC、gM、gN等，除gG外均為成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)成分，gG常存在于感染細(xì)胞分泌物中[4]。

2 偽狂犬病毒表達(dá)載體的優(yōu)越性

基因組龐大，含有多個復(fù)制非必需區(qū)，其容量可高達(dá)40Kb，可在其感染的細(xì)胞中忠實(shí)的進(jìn)行修飾，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間較長的體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)。除此之外，偽狂犬病毒的宿主范圍較大，能感染多種動物和野生動物，這就為一苗多用打下了很好的基礎(chǔ)。最為重要的是在重組偽狂犬病毒中所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以進(jìn)行翻譯后加工、修飾，其中許多過程與體內(nèi)相類似，因此表達(dá)產(chǎn)物具有天然蛋白質(zhì)的活性，并且保留了其相應(yīng)的抗原性、免疫原性及功能。

3 重組偽狂犬病毒的構(gòu)建

3.1 構(gòu)建原理 重組偽狂犬病毒的構(gòu)建應(yīng)分兩部分進(jìn)行：第一步是構(gòu)建重組質(zhì)粒。此質(zhì)粒應(yīng)含有啟動子，下游接表達(dá)的外源基因，有時(shí)為篩選方便，還要插入有啟動子標(biāo)記的基因如LacZ等，它們的兩側(cè)是偽狂犬病毒特異的DNA同源序列；第二步是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入偽狂犬病毒感染的細(xì)胞中，偽狂犬病毒DNA與重組質(zhì)粒中的同源序列在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，從而將外源基因裝到偽狂犬病毒基因組的特定部位，構(gòu)建出重組病毒。

3.2 篩選方法 目前最常用的方法是通過化學(xué)底物及顏色變化等來篩選重組病毒，即插入報(bào)告基因法，將β-半乳糖苷酶(LacZ)基因或者抗生素基因等與外源基因同時(shí)導(dǎo)入偽狂犬病毒基因組中，通過在培養(yǎng)液中加入Xgal、G418等試劑來篩選重組病毒。

3.3 外源基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu) 目前，構(gòu)建重組偽狂犬病毒所選用的主要是gG、gE啟動子，因其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且活性較強(qiáng)。一般說來，啟動子序列距外源基因起始密碼子越近時(shí)表達(dá)效果越好。

3.4 構(gòu)建重組病毒注意事項(xiàng) 復(fù)制非必需區(qū)TK、gG、gE基因是目前應(yīng)用較多的同源序列。再者，還必須做好親本病毒株的選擇，它應(yīng)該是目前常規(guī)使用的疫苗株，從而才能夠不引起宿主發(fā)?。辉倬褪强紤]其親本株的宿主特異性，以對其它動物不構(gòu)成威脅為前提。最后還要考慮到它所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的類型，是全身性免疫應(yīng)答還是局部的黏膜免疫應(yīng)答。

4 豬偽狂犬病毒載體的研究進(jìn)展

4.1 PRV載體的構(gòu)建 目前，PRV基因缺失疫苗株常常是通過缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，缺失分為單基因缺失和多基因缺失。（1）第1代基因缺失疫苗株。第1代基因缺失疫苗是指缺失PRV TK基因的疫苗， 世界上第1個獲得批準(zhǔn)使用的基因弱毒疫苗就是偽狂犬的TK缺失疫苗株BUK2dl3[5]，該病毒株通過基因工程技術(shù)在TK基因引入缺失，在細(xì)胞培養(yǎng)上不能回復(fù)為TK+，對豬不僅沒有毒力而且具有較好的免疫原性。（2）第2代基因缺失疫苗株。第2代基因缺失疫苗以缺失TK基因?yàn)榛A(chǔ)，進(jìn)而缺失編碼非必需糖蛋白gE、gI、gG、gC等基因，使該疫苗免疫的動物不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，有利于通過血清學(xué)方法區(qū)分強(qiáng)毒感染豬和疫苗免疫豬，這也是其最顯著的特點(diǎn)，因此該種疫苗又被稱為標(biāo)記疫苗[6]，從而為凈化和根除偽狂犬病提供了有力的工具。TK-/gC-疫苗株：1987年KitS等[7]報(bào)道在PRVBUK2d13株的基礎(chǔ)上通過缺失gC基因SaII片段的1100bp構(gòu)建出了缺失TK、gC基因的PRVdlgC/dlTK株。TK-/gE-疫苗株：該疫苗株是從NIA23和NIA24發(fā)展而來的。首先將無毒株NIA24株基因組的HindIII片斷與野毒株NIA23基因組的被引入缺失HindⅢB片斷共轉(zhuǎn)染PK22細(xì)胞，病變后，空斑篩選病毒，然后將其基因組與一個TK基因的EcoRI位點(diǎn)引入有EcoRI接頭的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK22細(xì)胞，在BrdU存在下篩選在TK基因含有EcoRI位點(diǎn)的重組病毒。將此重組病毒的基因組用EcoRI完全酶切后共轉(zhuǎn)染PK22細(xì)胞，即得到重組病毒TK-/gE-即“783”[8]。

在國內(nèi)，郭萬柱教授率先系統(tǒng)地開展了偽狂犬病病毒(PRV)分子生物學(xué)研究[9]，首次構(gòu)建了PRVFa株TK基因缺失株，PRVFagI-/gI-基因缺失株，PRVFagI-/gI-/LacZ+基因缺失株，又將構(gòu)建的PP63lacZ轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與PRVFa DNA經(jīng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，在MDBK細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得PRVFagE-/gI-/TK-/LacZ+三基因缺失疫苗株(PRV2SA 215)，PRV2SA215是我國首次成功研制出的FagE-/gI-/TK-/LacZ+三基因缺失疫苗株，填補(bǔ)了我國在這一領(lǐng)域的空缺。

4.2 外源基因在載體中的表達(dá) 徐高原[10]構(gòu)建了表達(dá)乙型腦炎病毒NS1基因的重組PRVTK-/gG-/LacZ+/NS1株，經(jīng)檢測，重組病毒能表達(dá)具有生物活性的NS1蛋白，該重組病毒有望作為豬乙型腦炎和偽狂犬病雙價(jià)基因工程疫苗。范偉興等[11]在PRV疫苗Bartha株的TK基因中插入增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的整個表達(dá)盒，又將豬瘟病毒的E2基因插入到EGFP基因的多克隆位點(diǎn)區(qū)，經(jīng)BUDR篩選到了融合表達(dá)EGFP和CSFVE2基因的重組病毒TKPRVrGE2，免疫接種試驗(yàn)在豬體內(nèi)可以產(chǎn)生抗PRV和CS2FV的抗體。QianP等[12]將gG啟動子控制下的口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因插入PRV基因組中的gG基因的N端下游，得到重組病毒PRV2VP1。周國輝[13]選擇呈gE-表型的PRV經(jīng)典弱毒疫苗Bartha2K61株為載體，構(gòu)建了表達(dá)H3N2亞型SIVHA基因的重組PRV。羅燕等[14]成功地構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因的豬細(xì)小病毒-偽狂犬重組病毒，為研制豬細(xì)小病毒-偽狂犬病重組疫苗創(chuàng)造了條件。這些工作極大地推動了偽狂犬病毒在基因工程載體方面的研究。

[1]殷震, 劉景華.動物病毒學(xué)[M].第2版.北京: 科學(xué)出版社, 1997.

[2]LADINBF, IHARAS, HAMPLH, etal.Pathway of assembly of herpesvirus capsids: ananalysis using DNA+temperature2 sensitive mutants of pseudo rabies virus[J].Virology, 1982, 116: 544-561.

[3]REATJ, TIMMINSJG, LONGW, etal.Mapping and sequence of the gene for the pseudo rabies virus glycoprotein which accumulates in the medium of infected cells[J].JVirol, 1985, 54(1): 21-29.

[4]PENSAERTM, GIELKENSALJ, LOMNICZIB, etal.Round table on control of Aujeszky’s disease and vaccined evelopment based on molecular biology[J].Vet Microbiol, 1992, 33: 53-67.

[5]KITS, KITM, PIRTLEEC.Attenuated properties of thymidine kinase 2 negative Deletion mutant of pseudo rabies virus [J].AmJVetRes, 1985, 46: 1359-1367.

[6]VANZIJIM, WENSVOORTG, DEKLUYVERE, etal.Live attenuated PRVex2 Pressing envelopegly coprotein Elofhogcholera[J].Virol, 1991, 65: 2761-2765.

[7]KITS, SHEPPARDM, ICHIMURAH, etal.Second 2generation pseudo rabies Virus vaccine with deletionsin thymidine kinase and glycol protein genes[J].Am VetRes, 1987, 48: 780-793.

[8]VANOIRSCHOTJT, GIELKENSALJ, MOOMANNRJM, etal.Markervac2 cines, virus protein2 specific antibody assays and the control of Aujeszky’sdis ease[J].VeterinaryMicrobiology, 1990, 23: 85-101.

[9]郭萬柱.偽狂犬基因缺失疫苗的研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1999(12): 57-63.

[10]徐高原.乙型腦炎病毒NS1基因重組偽狂犬病毒的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2004, 35(2): 192-197.

[11]范偉興, 張雪蓮, 魏榮等.含綠色熒光蛋白基因和豬瘟E2基因的偽狂犬病毒Bartha2k61株TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)雜志, 2003, 39(3): 3-7.

[12]QIANP, LIXM, JINML, etal.Anapproach to a FMD vaccine based on ge2Neticengineered attenuated pseudorabies virus:one experiment usingVP1Geneal one generates an antibody respondson FMD and pseudo rabiesin swine[J].Vaccine, 2004, 22(17/18): 2129-2136.

[13]周國輝.表達(dá)H3N2亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病毒的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 36(10): 1043-1048.

[14]羅燕, 郭萬柱, 徐志文等.含綠色熒光蛋白基因的豬細(xì)小病病毒-偽狂犬病毒重組病毒的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 36(10): 1064-1068.