武昆，王曉英，姚合斌

低鉀型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis，HPP)包括家族性或散發(fā)性和甲狀腺功能亢進性周期性麻痹，是常染色體顯性遺傳性肌肉病，以伴隨血清鉀降低的發(fā)作性肌無力為特征，肌無力經(jīng)常累及四肢，嚴重者可死于呼吸肌麻痹或血清鉀降低所致的心律失常[1-3]。近年來通過遺傳學、分子生物學和電生理學的聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)，HPP是由離子通道基因突變所致的離子通道病，涉及的離子通道基因包括編碼骨骼肌電壓門控鈣通道α1亞單位基因(CACNA1S)和編碼骨骼肌電壓門控鈉通道α亞單位基因(SCN4A)。1994年，Ptácek等[4]和Jurkat-Rott等[5]幾乎同時報道了本病是由于二氫吡啶受體敏感的鈣離子通道(L型鈣通道)α1亞基(CACNA1S)的DNA序列點突變所致。此后1999年，Bulman等[6]在編碼電壓門控鈉離子通道α亞單位的SCN4A基因上發(fā)現(xiàn)存在點突變(Arg669→His)。到目前為止，國內(nèi)外研究者們在CACNA1S和SCN4A中已發(fā)現(xiàn)了多個突變位點。

本文針對2個家族性HPP家系、1個甲亢性HPP家系及4例散發(fā)性HPP患者，采用PCR和DNA直接測序技術對CACNA1S、SCN4A基因突變位點進行檢測，并對相關文獻進行回顧，以期在基因水平上為該病的發(fā)病機制和流行病學研究提供更多證據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2個家族性HPP家系6例患者及其親屬，1個甲亢性HPP家系2例患者，4例散發(fā)性HPP患者。家族性HPP家系A(圖1A)，3代2例患者。家族性HPP家系B(圖1B)，3代4例患者。甲亢性HPP家系C(圖1C)，3代1例患者。所有患者均表現(xiàn)為突然發(fā)作的低血鉀和周期性發(fā)作的骨骼肌遲緩性癱瘓。先證者均接受血生化、血氣分析、甲狀腺功能、甲狀腺及腎上腺B超、尿常規(guī)等輔助檢查。

圖1 HPP家系Fig. 1 Pedigrees of HPP A. Pedigree A of a Chinese familial HPP; B. Pedigree B of a Chinese familial HPP; C. Pedigree C of a Chinese hyperthyroid HPP; □represents the healthy male; ○represents the healthy female; represents the male patient; ●represents the female patient; ↗represents the proband

1.2 基因檢測方法 所有患者及其家屬簽署知情同意書后，取外周血3ml，應用試劑盒(WizardTMGenomic DNA Purification Kit，美國Promega)提取基因組DNA。自行設計CACNA1S基因外顯子11、20、21、22、26、30及SCN4A基因外顯子5、12、18、19引物(表1)，利用PCR技術對外顯子進行擴增，引物由奧科生物工程技術公司合成。PCR反應體系50μl，含DNA 50ng，引物0.2μmol/L，dNTP 100μmol/L，Taq DNA聚合酶2U(康為公司)。反應條件：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；延伸5min。應用2%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，用Promega凝膠回收試劑盒(申能博采生物技術公司)回收PCR產(chǎn)物。以回收產(chǎn)物為模板再行PCR擴增，之后對PCR產(chǎn)物再次回收。用DNA測序儀(Prism 377，美國ABI)對回收后的PCR產(chǎn)物行正反向測序，明確有無突變。

1.3 文獻檢索及分析 檢索PubMed數(shù)據(jù)庫，搜集1999年1月－2012年12月公開發(fā)表的關于HPP家系CACNA1S、SCN4A基因突變的相關文獻，關鍵詞為“低鉀型周期性麻痹”、“CACNA1S”、“SCN4A”、“突變”等，檢索語種為英文。文獻納入標準：研究對象相同(不包括繼發(fā)性HPP人群)，研究方法相似，病例診斷標準相同，提供充足的原始資料。排除標準：重復發(fā)表的文獻，未提供充足原始數(shù)據(jù)的文獻，Meta分析類文獻，綜述類文獻。

表1 CACNA1S和SCN4A基因待檢測位點外顯子PCR引物Tab. 1 PCR primers applied for detection of target exons in gene CACNA1S and SCN4A

2 結 果

2.1 診斷及臨床資料 診斷標準參照文獻[7]進行：根據(jù)常染色體顯性遺傳或散發(fā)，突發(fā)四肢弛緩性癱瘓，近端為主，無腦神經(jīng)支配肌肉損害，無意識障礙和感覺障礙，數(shù)小時至1d內(nèi)達高峰，輔助檢查示血鉀降低，心電圖呈低鉀性改變，經(jīng)補鉀治療肌無力迅速緩解。

2個家族性HPP家系患者具有典型癥狀，結合家族史可以獲診斷。另外1個甲亢性HPP家系的1例患者具有甲亢和HPP的臨床表現(xiàn)，并經(jīng)甲狀腺功能測定證實甲狀腺功能亢進，同時排除其他繼發(fā)性因素，獲得診斷。4例散發(fā)患者根據(jù)典型HPP癥狀，排除家族史及其他繼發(fā)性原因，獲得診斷。

病史和臨床特征見表2。家系A：先證者(Ⅲ8)，男，23歲。22歲開始出現(xiàn)遲緩性四肢無力，多由雙下肢開始，數(shù)小時逐漸蔓延至雙上肢。一般在晨起時發(fā)作，口服氯化鉀緩釋片(商品名：補達秀)治療持續(xù)12～24h后肢體肌力可逐漸恢復正常，無肌強直表現(xiàn)。平時一直口服氯化鉀緩釋片和氯化鉀口服液預防發(fā)作。發(fā)作誘因有勞累、受涼、寒冷、晚餐進食過飽、情緒緊張、酗酒、喝碳酸類飲料、運動后大量出汗等，寒冷可使癥狀加重。在起病初發(fā)作頻率10－15次/年，23歲開始病情逐漸加重。發(fā)作期檢查：血鉀1.4～2.5mmol/L(平均1.9mmol/L)；心電圖示T波低平，U波增高；但多次查血氣分析、尿常規(guī)、腎功能、甲狀腺功能、甲狀腺及腎上腺B超、肌電圖均正常。

表2 HPP家系患者臨床特征Tab. 2 Clinical features of patients with hypokalemic periodic paralysis

家系B：先證者(Ⅱ3)，女，46歲，首發(fā)年齡40歲。一般在睡眠中發(fā)病，持續(xù)24h后肢體肌力恢復正常。誘因主要有勞累、受涼、出汗、飽食、月經(jīng)前期等。發(fā)作頻率：15~20次/年。發(fā)作期檢查：血鉀偏低(1.8mmol/L)，尿常規(guī)、肌電圖正常。補鉀治療有效，乙酰唑胺治療無效。

家系C：先證者(Ⅱ7)，男，48歲，首發(fā)年齡43歲。甲狀腺功能亢進病史10年，一般在飲酒、勞累后發(fā)病，持續(xù)24h后肢體肌力恢復正常。誘因主要有勞累、受涼、出汗、飲酒等。發(fā)作頻率∶10~15次/年。發(fā)作期檢查：血鉀偏低(2.5mmol/L)，尿常規(guī)、肌電圖正常?？诜泟┯行А?/p>

2.2 DNA測序結果 見圖2、3、4、5。家系A共3代41人(檢測33人，Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ3、Ⅲ5失訪)，其中2例發(fā)病者為先證者及其爺爺，均為男性。先證者，男，23歲，首發(fā)年齡22歲；先證者爺爺，76歲，首發(fā)年齡56歲。本研究中，患者及其家族成員的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序未在目前已報道的突變位點中發(fā)現(xiàn)突變。家系B共3代26人(檢測20人，Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅱ10失訪)，其中4例發(fā)病。發(fā)病者中男性3例，女性1例。先證者為女性，46歲，首發(fā)年齡40歲。3例男性均是先證者的兄弟。本研究中，家系B中的患者及家族成員，其PCR產(chǎn)物經(jīng)測序也未發(fā)現(xiàn)突變。家系C共3代16人(檢測12人，Ⅱ2、Ⅱ4失訪)，其中1例發(fā)病。先證者，男，48歲，首發(fā)年齡43歲。本研究中，患者及其家族成員的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)目前已知突變。4例散發(fā)性周期性麻痹患者的測序結果也無陽性發(fā)現(xiàn)。

圖2 正常對照、已報道HPP突變位點及HPP家系先證者CACNA1S基因外顯子11第528位氨基酸附近的序列圖Fig. 2 Sequence map of amino acids at position 528 and nearby on exon 11 in gene CACNA1S of normal control, the reported mutation site of HPP and the proband of HPP pedigree

圖3 正常對照及HPP先證者CACNA1S基因外顯子11第1567至1596位堿基測序圖Fig. 3 Sequence map of basic radicals ranging from 1567bp to 1596bp on exon 11 in gene CACNA1S of normal control and the proband of HPP pedigrees

圖4 正常對照、已報道HPP突變位點及HPP家系先證者SCN4A基因外顯子12第672位氨基酸附近的序列圖Fig. 4 Sequence map of amino acids at position 672 and nearby on exon 12 in gene SCN4A of normal control, the reported mutation site of HPP and the proband of HPP pedigree

圖5 正常對照及HPP家系先證者SCN4A基因12外顯子1999至2028位堿基測序圖Fig. 5 Sequence map of basic radicals ranging from 1999bp to 2028bp on exon 12 in gene SCN4A of normal control and the proband of HPP pedigrees

2.3 文獻分析結果 檢索到符合標準的文獻92篇，按排除標準進行排除和篩選，最后納入文獻9篇，其中西方白種人群個案報道4篇、HPP家系基因突變文獻5篇。在個案報道中3篇報道了CACNA1S突變[8-10]，1篇報道了SCN4A突變[6]；在HPP家系基因突變文獻中，多是西方白種人群大樣本研究，相關突變的基因也是以CACNA1S為主。除了檢索相關西方白種人群的文獻，對中國人群及東亞人群進行的相關檢索發(fā)現(xiàn)，個案報道7篇[11-17]，多為CACNA1S突變；家系基因突變的文獻7篇[18-24]，但樣本量較小，多為單個家系研究。到目前為止，國內(nèi)外研究者均在CACNA1S和SCN4A發(fā)現(xiàn)了多個突變位點(表3)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，西方白種人群的基因突變以家族性為主，散發(fā)性突變較少；HPP突變家系的樣本量大于中國人群及東亞人群；CACNA1S及SCN4A基因的突變陽性率為33.3%~87.9%。

3 討 論

HPP是顯性遺傳性疾病，為周期性麻痹(periodic paralysis，PP)中最常見的類型，因各種因素影響使本病外顯不全。本病的基因突變可能來自于父母或患者本人基因發(fā)生的突變。本研究患者父母及親屬無相應突變，因此，筆者推測家系A中第2代沒有發(fā)病者，隔代出現(xiàn)了發(fā)病者的情況可能與患者本人基因突變有關。

本病以發(fā)作性肌無力伴發(fā)作期血鉀降低、補鉀后癥狀迅速緩解為特征。HPP發(fā)病以青壯年為多，多在睡眠中發(fā)病，臨床主要表現(xiàn)為對稱性雙下肢無力，逐漸向上發(fā)展，以近端較重。發(fā)作時神志清楚，呼吸、吞咽、咀嚼、發(fā)音、眼球運動常不受影響，嚴重病例可累及呼吸肌甚至死亡[25]。不同患者的初發(fā)年齡、持續(xù)時間、嚴重程度及發(fā)作周期各異[26-27]。目前低鉀型周期性麻痹主要通過臨床病史、發(fā)病時血清鉀濃度以及補鉀治療有效等情況進行診斷，而基因分析可協(xié)助臨床診斷的確定。

表3 HPP患者CACNA1S和SCN4A基因已確認的突變位點Tab. 3 Verified mutation sites in patients with hypokalemic periodic paralysis

在目前西方人群大樣本研究中，以Sternberg等[28]及Matthews等[29]所做的研究為代表。據(jù)Sternberg等[28]報道，在58個獨立的家族性HPP家系中，突變的陽性率為77.6%。其中40個家系與CACNA1S基因突變有關，比例為69.0%，包括R528H突變和R1239H突變，分別占45.0%和24.0%；5個家系與SCN4A基因突變有關，比例為8.6%；其余13個家系無突變。2011年， Matthews等[29]報道在83個獨立的HPP患者中突變陽性率為87.9%，其中65例(78.3%)為CACNA1S突變，8例(9.6%)為SCN4A突變。在東方人群中，目前報道的突變位點與西方基本相同，但CACNA1S及SCN4A基因突變陽性率低于西方人群，即使是與西方人群不同的突變位點，其突變也多是個案報道[17,19]。

在目前的突變位點中，主要是以R528H、R1239H為常見，其他突變相對少見。在此前的工作中，我們發(fā)現(xiàn)了少見的R528G突變[30]，在甲亢合并HPP家系發(fā)現(xiàn)了罕見的F671S突變，但是在后續(xù)的散發(fā)性PP和甲亢PP患者以及5個家系研究中未再有陽性突變發(fā)現(xiàn)。國內(nèi)其他學者也遇到過類似陽性率低的現(xiàn)象，甚至有突變陰性的報道。柯青等[25]在14個家系中對先證者CACNA1S、SCN4A基因突變熱點進行了篩查，結果僅發(fā)現(xiàn)1例R1239H突變及2例R672H突變，基因突變陽性率為21.4%；隨后對71例散發(fā)患者進行測序，僅1例存在R672C突變。臺灣學者篩查了甲亢和散發(fā)性PP患者CACNA1S和SCN4A基因常見的突變R528H、R1239H，結果36例甲亢PP患者突變陰性，12例散發(fā)性PP患者僅1例存在R528H突變，散發(fā)性PP的陽性率為8.3%[23]。此后臺灣學者Sung等[31]報道，60例散發(fā)性PP患者在CACNA1S及SCN4A基因中只發(fā)現(xiàn)了4例突變，包括1例R1239H、2例R669H和1例R1135H，陽性率僅6.6%。與此相類似，Kung等[32-33]也曾分別對97例和49例甲亢PP的中國香港人群進行基因測序，均未發(fā)現(xiàn)突變。

根據(jù)目前已發(fā)表的大量文獻，中國人群中CACNA1S基因和SCN4A基因的突變陽性率遠低于西方白種人，提示HPP的突變基因存在種族差異；除了目前報道的突變基因外，中國人群還存在其他致病基因或導致血鉀降低的因素。雖然在西方白種人中，HPP的發(fā)生原因是CACNA1S和SCN4A基因突變，但中國人群的發(fā)病原因可能與西方人群并不完全一致。因此，在此后的研究中，我們考慮需要尋找與西方白種人不同的突變基因，不能只局限于CACNA1S基因和SCN4A基因；同時可通過建立已知常見突變位點的動物模型，對其進行病理生理研究，以促進基因突變的研究。

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