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        毫米波急性輻照對(duì)大鼠脊髓P物質(zhì)和c-fos表達(dá)的影響

        2013-04-01 01:38:34張彥文姚權(quán)許商成余爭(zhēng)平張廣斌
        解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2013年4期
        關(guān)鍵詞:傷害性節(jié)段脊髓

        張彥文,姚權(quán),許商成,余爭(zhēng)平,張廣斌

        隨著電子技術(shù)的不斷進(jìn)步,毫米波技術(shù)迅猛發(fā)展,且廣泛應(yīng)用于通訊、遙感、地下探測(cè)、導(dǎo)航、醫(yī)療等方面。毫米波在醫(yī)療方面的應(yīng)用與其熱效應(yīng)有關(guān)。較低劑量毫米波輻照下,皮膚溫度上升緩慢,且上升幅度有限,可保持一定的熱效應(yīng)從而達(dá)到治療的目的。但較高劑量的毫米波輻照可使皮膚溫度快速上升,較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到痛覺閾值,產(chǎn)生劇烈疼痛,如持續(xù)輻照則可產(chǎn)生皮膚損傷甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),較高劑量毫米波(35GHz)急性輻照30s,SD大鼠皮膚溫度即可達(dá)48℃以上,產(chǎn)生疼痛反應(yīng),造成皮膚損傷,且大鼠局部皮膚中P物質(zhì)(substance P,SP)含量明顯升高[3]。脊髓是疼痛沖動(dòng)向高級(jí)中樞傳遞的中轉(zhuǎn)站,是疼痛傳入系統(tǒng)的重要組成部分,對(duì)疼痛的傳入起調(diào)制作用。本研究通過檢測(cè)脊髓SP和c-fos的表達(dá)變化,進(jìn)一步探索毫米波痛覺效應(yīng)的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑 RT-PCR試劑盒、SYBER Green I熒光染料購自Toyoba公司,小鼠抗c-fos單克隆抗體(2G9C3)購自美國Abcam公司,小鼠抗GAPDH單克隆抗體(KC-5G4)購自上海康成公司。

        1.2 主要儀器 Bio-Rad普通PCR儀和定量PCR儀,Du-640紫外分光光度計(jì),水平電泳儀,垂直電泳儀,凝膠圖像成像系統(tǒng),Bio-Rad蛋白電泳系統(tǒng),Odyssey熒光掃描儀。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年SD大鼠96只,雌雄各半,體重250±20g,由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,自由進(jìn)水、飲食。隨機(jī)分為對(duì)照組、輻照30s組、輻照1min組、輻照3min組,每個(gè)輻照組在輻照后又分為0min、5min、10min、1h、3h五個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

        1.4 輻照模型 將大鼠置于毫米波反射系數(shù)為零的毫米波暗室內(nèi)進(jìn)行輻照,室內(nèi)溫度控制在20℃,相對(duì)濕度80%。輻照前大鼠背部局部脫毛,輻照時(shí)將大鼠放置于自制容器中固定,局部脫毛皮膚暴露于毫米波焦斑處,用毫米波(35GHz,40W/cm2)分別輻照30s、1min、3min。毫米波輻照后,以20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠,剪開背部皮膚及肌肉組織,取出輻照皮膚對(duì)應(yīng)節(jié)段的脊髓組織,用生理鹽水洗去血跡,備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.5 Real-time RT-PCR檢測(cè)大鼠脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá) 取脊髓組織標(biāo)本(每只大鼠50mg左右),采用Trizol試劑盒提取總RNA,具體操作按說明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)電泳鑒定,并行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)含量及純度后備用。取總RNA 1.0μg,65℃變性5min后冷卻,加入M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶,在總體積20μl的反應(yīng)體系中42℃反應(yīng)60min,85℃、5min滅活M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶,冷卻至4℃用于Realtime PCR。Real-time PCR反應(yīng)條件:95℃ 30s;95℃15s,58℃ 20s,40個(gè)循環(huán);72℃ 90s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)含量。引物序列如下:GAPDH上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3',下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3',擴(kuò)增片段長度138bp;SP上游5'-ACTGGTCCGACAGTGACCAAATC-3',下游5'-CCCGTTTGCCCATTAATCCA-3',擴(kuò)增片段長度117bp;c-fos上游5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3',下游5'-AAAGTTGGCACTAGAGACGGACAGA-3',擴(kuò)增片段長度170bp。

        1.6 Western blotting檢測(cè)大鼠脊髓c-fos蛋白表達(dá)取脊髓組織標(biāo)本(每只大鼠50mg左右),加入1ml組織蛋白裂解液,勻漿,冰上冷浴30min,4℃條件下20 000×g離心30min,取上清,Lowry法測(cè)定蛋白含量,分裝,-80℃保存。制備15%分離膠和5%濃縮膠,取100μg總蛋白上樣后電泳。先用80V電壓將樣品電泳至分離膠面,然后調(diào)整電壓至100V,電泳100min,轉(zhuǎn)印至NC膜上(150mA,40min),于PBS配制的5%脫脂奶粉中封閉3h,1∶10 000小鼠抗GAPDH室溫孵育90min。取出孵育完畢的NC膜,用0.1% TBST在搖床上中度洗膜10min×3次,置于小鼠c-fos單克隆抗體(1∶1000)中室溫?fù)u床孵育3h,以TBST洗滌10min×3次,置于山羊抗小鼠紅色熒光二抗(1∶5000)中,室溫于搖床上輕度晃動(dòng),避光孵育1h,TBST避光洗滌10min×3次,PBS洗膜5min×2次,蒸餾水漂洗,除去殘留的TBST;采用Odyssey熒光掃描分析測(cè)定吸光度(A)值。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示,組間比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 SP、c-fos、GAPDH PCR產(chǎn)物的電泳鑒定Real-time RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,SP、c-fos和GAPDH擴(kuò)增片段長度與實(shí)際相符,無非特異性擴(kuò)增,無DNA污染(圖1)。

        2.2 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s,輻照后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05,圖2)。

        圖1 大鼠脊髓SP、c-fos、GAPDH PCR產(chǎn)物的電泳鑒定Fig. 1 Identification of SP, c-fos and GAPDH PCR production in rat spinal cord1. DNA marker; 2. GAPDH; 3. c-fos; 4. SP; 5. Negative control

        2.3 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min,在輻照后10min對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05,P<0.01),而其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較均無明顯差異(P>0.05,圖3)。

        圖2 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚30s后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 2 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to millimeter wave (MMW) for 30s in rats (n=6)

        圖3 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚1min后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 3 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 1min in rats (n=6)(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with control

        2.4 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚3min后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)的變化 經(jīng)毫米波輻照大鼠局部皮膚3min,在輻照后5min和10min對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01),輻照后1h仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而輻照后即刻和3h與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05,圖4)。

        2.5 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚對(duì)對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響 毫米波急性輻照SD大鼠局部皮膚30s和1min后,對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05);而經(jīng)毫米波輻照大鼠局部皮膚3min,在輻照后5min及10min對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓c-fos蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01),其他時(shí)間點(diǎn)c-fos蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05,圖5)。

        圖4 毫米波急性輻照大鼠局部皮膚3min后對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos mRNA表達(dá)變化(n=6)Fig. 4 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 3min in rats (n=6)(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with control

        3 討 論

        脊髓背角是疼痛沖動(dòng)向高級(jí)中樞傳遞的中轉(zhuǎn)站,是疼痛傳入系統(tǒng)的重要組成部分,也是腦干下行抑制的作用部位,對(duì)疼痛的傳入起調(diào)制作用。解剖學(xué)、免疫組織化學(xué)研究揭示,感覺神經(jīng)元及其周圍和中樞的投射區(qū)內(nèi)存在一些肽類,其中包括SP[4]。SP由速激肽家族的前速激肽A基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工后產(chǎn)生,在傷害性刺激、炎性反應(yīng)、腺體分泌、變態(tài)反應(yīng)中均具有不同作用。SP通過受體參與脊髓傷害性信息的傳遞,在痛覺調(diào)制中發(fā)揮重要作用[5-6]。

        研究表明,SP可加強(qiáng)C纖維誘發(fā)的脊髓背角傷害性神經(jīng)元放電,在貓脊髓背角微電泳導(dǎo)入SP可引起傷害性感受神經(jīng)元的去極化,其時(shí)程與誘發(fā)放電的興奮效應(yīng)相平行,表明傷害性初級(jí)傳入釋放的SP能作用于突觸后神經(jīng)元,使突觸后膜發(fā)生離子通透性變化及電位變化,從而改變突觸后神經(jīng)元的功能狀態(tài),激活傷害感受神經(jīng)元,完成信息傳遞的功能[7]。由此可見SP是傷害性傳入末梢釋放的一種興奮性遞質(zhì),在脊髓水平參與傷害性信息傳遞,產(chǎn)生致痛作用。傷害性刺激可引起脊髓背角傷害性敏感神經(jīng)元興奮,背根神經(jīng)節(jié)小型神經(jīng)元胞體內(nèi)合成的SP經(jīng)快速軸漿運(yùn)輸至初級(jí)傳入神經(jīng)元的外周端神經(jīng)末梢,使局部皮膚SP含量升高。前期研究發(fā)現(xiàn),毫米波急性輻照后局部皮膚SP含量升高(輻照后第5min和10min顯著升高)[3],這可能是由于對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP mRNA表達(dá)水平升高導(dǎo)致合成的SP蛋白增加,然后經(jīng)快速軸漿運(yùn)輸至皮膚游離神經(jīng)末梢所致。

        即刻早期基因是指在受到外界刺激時(shí)機(jī)體在短期(數(shù)分鐘)內(nèi)即刻表達(dá)的基因,甚至不被蛋白合成抑制劑所阻斷,其轉(zhuǎn)錄是快速、一過性的,在體內(nèi)發(fā)揮第三信使的作用。c-fos原癌基因是即刻早期基因中的一種,參與細(xì)胞的正常生長、分化過程,c-Fos蛋白可耦聯(lián)細(xì)胞外信息與細(xì)胞內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄,是激活神經(jīng)元的第二信使與目的基因表達(dá)之間的信息傳遞中介,起到核內(nèi)第三信使的重要作用,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)與痛覺調(diào)控密切相關(guān)[8]。在正常生理狀態(tài)下,c-fos基因在多種細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá),但缺氧、光線刺激、機(jī)械刺激、疼痛刺激等可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達(dá),是刺激作用下最早的反應(yīng)基因[9],且其表達(dá)可作為接受一定刺激后神經(jīng)元激活的標(biāo)志[10]。但不同的刺激是否通過共同的機(jī)制誘導(dǎo)c-fos表達(dá),或者不同的刺激有不同的誘導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚。

        圖5 毫米波急性輻照對(duì)脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響(n=6)Fig. 5 Effects of acute MMW irradiation on c-fos protein expression in rat spinal cord (n=6)(1)P<0.01 compared with control

        各種傷害性刺激均可誘導(dǎo)c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多級(jí)神經(jīng)元中的表達(dá)。在脊髓水平,急性疼痛刺激后2h,c-fos的表達(dá)即可作為神經(jīng)元活化的標(biāo)志物[11]。脊髓存在不同的傷害性傳入通路,盡管表達(dá)部位、時(shí)程、數(shù)量有一定差異,但其表達(dá)多出現(xiàn)在疼痛相關(guān)區(qū)域[12]。作為快速反應(yīng)基因家族的一員,c-fos基因的表達(dá)具有快速、短暫的時(shí)間依賴性特征。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激作用時(shí),中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos基因在數(shù)分鐘內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá),解除相應(yīng)刺激后,其表達(dá)也很快消失,不能持續(xù)。

        既往研究發(fā)現(xiàn),外周傷害性刺激后脊髓內(nèi)初級(jí)傳入神經(jīng)末梢釋放SP、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì),可影響突觸后神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+濃度,提高cAMP水平,導(dǎo)致c-fos基因的表達(dá)[13]。同時(shí),SP與其相應(yīng)的受體結(jié)合也可促進(jìn)c-fos的表達(dá)[14]。外周傷害性熱刺激也可引起大鼠脊髓c-fos的表達(dá)增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn),毫米波急性輻照大鼠局部皮膚后,對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓c-fosmRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào),且與脊髓SP mRNA表達(dá)和皮膚SP含量變化在時(shí)相上存在一定相關(guān)性[3],提示毫米波輻照后皮膚SP含量增加可能與輻照導(dǎo)致的熱疼痛刺激誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓SP和c-fos的表達(dá)增加有關(guān),但其具體作用途徑尚有待進(jìn)一步研究。

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