陳聰，康權(quán)，羅慶，迭小紅，田雯

骨形成蛋白家族成員2、7對小鼠胚胎肝干細胞分化的體外研究

陳聰，康權(quán)，羅慶，迭小紅，田雯

目的探討骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)對小鼠胚胎肝干細胞(HP14.5)定向誘導(dǎo)分化為肝細胞樣細胞的影響。方法將表達BMP2、BMP7、肝細胞生長因子(HGF)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組腺病毒作為4個組分別感染HP14.5，誘導(dǎo)其分化，在病毒感染后的第1、4、7天通過檢測熒光素酶報告基因讀數(shù)，在第7天通過細胞免疫熒光染色，觀察肝細胞標志物白蛋白(ALB)的表達情況；并在第4、7、10天通過PAS染色、尿素氮合成功能檢測，觀察誘導(dǎo)后HP14.5向肝細胞方向的分化成熟度。結(jié)果BMP2組、HGF組熒光素酶讀數(shù)較GFP對照組明顯上升；免疫熒光染色顯示，誘導(dǎo)7d后BMP2組、HGF組細胞質(zhì)內(nèi)表達肝細胞特有的ALB，而GFP對照組幾乎無表達；糖原染色可見BMP2組、HGF組胞質(zhì)存在紫紅色顆粒，呈陽性反應(yīng)；尿素合成功能檢測顯示BMP2組、HGF組培養(yǎng)液中尿素氮隨時間而升高。BMP7組誘導(dǎo)后，細胞免疫熒光染色、熒光素酶活性、PAS染色和尿素合成檢測均呈陰性或弱陽性反應(yīng)。結(jié)論BMP2具有一定的誘導(dǎo)HP14.5向成熟肝細胞分化的作用，并初步具備肝細胞的合成分泌功能，而BMP7對其無誘導(dǎo)作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；胚胎肝干細胞；細胞分化；重組腺病毒

自Wilson等[1]在小鼠營養(yǎng)性肝損傷修復(fù)機制研究中提出肝內(nèi)可能存在肝干細胞的假說以來，有關(guān)肝干細胞的研究受到了廣泛關(guān)注。目前認為肝干細胞主要包括肝卵圓細胞[2]、小肝細胞和胚胎肝干細胞(hepatic progenitor cells，HP)。胚胎肝干細胞是肝臟生長發(fā)育、再生的重要細胞來源，在小兒先天性肝病、代謝性肝病的終末期治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。因為HP的表型特征更接近肝細胞，在肝細胞的生長發(fā)育、重建再生方面具有一定優(yōu)勢[3]。本課題組在成功分離出小鼠胚胎肝干細胞的基礎(chǔ)上，使其達到了永生化。本研究進一步探討骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)家族成員BMP2、BMP7基因?qū)π∈笈咛ジ胃杉毎T導(dǎo)分化的影響，以篩選優(yōu)化小鼠胚胎肝干細胞體外培養(yǎng)的最佳誘導(dǎo)因素，建立有效的誘導(dǎo)肝干細胞定向分化為晚期成熟肝細胞的體外培養(yǎng)體系，為臨床肝細胞移植提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 永生化和含有白蛋白啟動子修飾的細胞株HP14.5(美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)分子腫瘤實驗室分離鑒定)、293細胞(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院干細胞實驗室保存)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，熒光素酶檢測試劑盒(NEB公司)，白蛋白(ALB)抗體及二抗(Santa Cruz公司)，Polybrene、糖原染色試劑盒、尿素氮檢測試劑盒(Sigma公司)。重組腺病毒Ad-BMP2、Ad-BMP7和Ad-HGF的構(gòu)建由本課題組完成、保存，測序工作由芝加哥大學(xué)分子實驗中心完成，上述病毒均經(jīng)RT-PCR驗證有目的基因的表達[4]，Ad-BMP2、Ad-BMP7和Ad-HGF帶GFP標簽蛋白，可以在熒光顯微鏡下觀察病毒的感染情況。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組 小鼠胚胎肝干細胞HP14.5培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃、5 % CO2條件下培育，間隔48h，0.25%胰酶消化傳代，備用。實驗分4組：BMP2組、BMP7組、肝細胞生長因子(HGF)組和綠色熒光蛋白(GFP)對照組，每組設(shè)置復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，于病毒感染HP14.5細胞后第1、4、7、10天4個時間點對其行特異性標志物及合成分泌功能檢測。

1.3 病毒感染HP14.5細胞滴度的確定 將HP14.5細胞接種于24孔板中，接種密度為1.5×105，待細胞貼壁后，倍比稀釋病毒上清，分別感染HP14.5細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用熒光顯微鏡觀察GFP熒光陽性的細胞數(shù)，按下式計算其病毒滴度，篩選出感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100的最合適的病毒滴度。病毒滴度(pfu/ml)=GFP熒光陽性細胞數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0.4。

1.4 熒光素酶活性檢測 將攜帶ALB-Gluc報告基因的HP14.5細胞接種于24孔板上，分別加入表達GBMP2、BMP7和HGF重組腺病毒，分別在感染后的第1、4、7、10天取上清液檢測熒光素酶活性。每組設(shè)置復(fù)孔，重復(fù)3次實驗，讀數(shù)取均值，按照說明書操作配置工作液，每20μl檢測工作液加入細胞上清液50μl，混勻后在波長為470nm的酶標儀上讀數(shù)。

1.5 細胞免疫熒光染色 將狀態(tài)良好的HP14.5細胞傳代接種于24孔培養(yǎng)板，至細胞密度約為1.5×105時，各組細胞分別加入重組腺病毒后繼續(xù)培養(yǎng)7d。細胞用PBS洗滌2～3次，4%多聚甲醛固定20min，含TritonX-100洗滌液漂洗3次后血清封閉，ALB一抗37℃孵育過夜，漂洗3次后標記二抗37℃孵育2h，漂洗3次后DAPI染核10min，漂洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況。

1.6 糖原染色 HP14.5細胞加入重組腺病毒培養(yǎng)，在第4、7、10天3個時間點行糖原染色。先棄掉培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次后，每孔加入250μl的4%多聚甲醛，室溫固定20min；PBS漂洗后加入高碘酸溶液500μl，室溫放置5min；PBS沖洗后加入Schiff溶液500μl染色15min，流水沖洗2min；再用蘇木素500μl染色1min，流水沖洗2min，加入1%氨水10s左右，流水沖洗后顯微鏡下觀察染色情況，用于反映細胞的糖原合成功能。

1.7 比色法檢測 4組細胞分別加入表達BMP2、BMP7、HGF誘導(dǎo)因子的重組腺病毒后進行分化培養(yǎng)，行比色法檢測尿素氮含量，并對第4、7、10天3個時間點的尿素氮含量進行對照分析，嚴格按照尿素氮檢測試劑盒說明書進行操作，孵育后在分光光度儀上選擇520nm波長檢測，獲取吸光度(A)讀數(shù)，計算待測樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒對HP14.5細胞的感染 重組腺病毒經(jīng)包裝細胞293細胞擴增純化后，再加入5μl Polybrene試劑，可有效感染小鼠胚胎肝干細胞HP14.5。最適病毒感染滴度如下，BMP2：1.2μl；BMP7：0.8μl；HGF：1μl；GFP：1μl。圖1為病毒感染48h后熒光顯微鏡下感染細胞的熒光量對比，可見4組細胞的病毒感染滴度近似，感染率約為70%，為后續(xù)分化實驗的可行性和均一性奠定了基礎(chǔ)。

圖1 病毒感染HP14.5細胞48h后的熒光表達(×100)Fig. 1 HP14.5 cells 48 hours after infection of recombinant adenovirus (Fluorescence microscope×100)

圖2 細胞因子誘導(dǎo)HP14.5細胞不同時間點熒光素酶活性Fig. 2 Luciferase activity in HP14.5 cells induced by different cytokine at different time-points

2.2 熒光素酶活性檢測結(jié)果 如圖2所示，與GFP對照組比較，BMP2組、HGF組ALB-Gluc表達水平在誘導(dǎo)后均有所增加，且隨著時間的延長而增加，在第7天達到峰值。BMP2組熒光素酶A值讀數(shù)接近HGF組，提示BMP2和HGF一樣，有誘導(dǎo)肝干細胞向成熟肝細胞樣細胞分化的作用。組間對比發(fā)現(xiàn)，BMP7組對HP14.5無誘導(dǎo)作用(P＞0.05)。

2.3 免疫細胞熒光染色結(jié)果 BMP7組、GFP對照組幾乎無紅色熒光，提示無肝細胞特征性標志物ALB的表達，即細胞未向肝細胞方向分化；而BMP2組和HGF組均出現(xiàn)明顯的紅色熒光，說明均有ALB表達，提示BMP2、HGF均可誘導(dǎo)肝干細胞向肝細胞樣細胞分化(圖3)。

圖3 細胞免疫熒光染色后ALB的表達情況(熒光顯微鏡 ×200)Fig. 3 ALB expression after cell immunofluorescence staining (Fluorescence microscope ×200)

2.4 PAS染色結(jié)果 誘導(dǎo)后第4、7、10天，BMP2組、HGF組均可見胞質(zhì)內(nèi)存在紫紅色顆粒，呈陽性反應(yīng)，并且隨著時間的延長明顯加深，在第10天最明顯，而BMP7組和GFP對照組無明顯變化，染色呈弱陽性或陰性，無糖原合成功能(圖4)。

2.5 比色法檢測結(jié)果 加入重組腺病毒誘導(dǎo)分化第4、7、10天，尿素合成功能讀數(shù)顯示，BMP2組和HGF對照組培養(yǎng)液內(nèi)均可見尿素氮的讀數(shù)逐漸升高，說明細胞具有尿素的合成和分泌功能，而BMP7組和GFP對照組讀數(shù)升高不明顯，提示沒有肝細胞的類似功能(圖5)。

3 討 論

肝干細胞又稱肝前體細胞，因其表形特征更接近肝細胞而具有增生分化的潛能，逐漸成為研究熱點[5-6]。近年來的研究顯示，肝干細胞對小兒先天性肝病終末期的治療具有重要的臨床應(yīng)用價值，為臨床細胞肝移植治療提供了新的思路[7]。肝干細胞的分化是一個復(fù)雜的變化過程，一些調(diào)控因子在促進分化的過程中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用[8]。本實驗采用膠原酶消化法從胎齡14d的小鼠胚胎肝臟中分離提取細胞，經(jīng)鑒定為小鼠胚胎肝干細胞，作為我們實驗研究的種子細胞[9-10]。

圖4 誘導(dǎo)后不同時間點PAS染色(×200)Fig. 4 PAS staining resulted post inducement at different time points (×200)

圖5 尿素合成功能的測定Fig. 5 Determination of urea synthesis function

在胚胎肝臟早期的發(fā)育過程中，BMP家族是非常重要的信號分子[11]。從Urist[12]在1956年首次發(fā)現(xiàn)并報道BMP以來，其功能早已超越了早期人們所認識的范圍，從促進骨生成擴展為涉及胚胎發(fā)育、骨骼發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)、精子發(fā)生及胎盤形成等多個領(lǐng)域。大量文獻報道BMP2、BMP7在促進干細胞分化方面有重要作用，例如Bai等[13]研究發(fā)現(xiàn)BMP7可促進胚胎干細胞分化為軟骨細胞，Sánchez-Camacho等[14]提出BMP7為腦胼胝體分化形成的必需因子，而BMP2為誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化為成骨細胞公認的誘導(dǎo)因子。也有文獻報道BMP2、BMP7在肝臟再生方面發(fā)揮了重要作用[15-16]，提示其在肝臟分化階段扮演著重要角色。我們前期課題組成功將BMP2-15基因克隆并構(gòu)建入重組腺病毒載體中[4]，獲得了高滴度的重組腺病毒表達，并且已發(fā)現(xiàn)BMP9在成骨方面有巨大作用[17-18]，因此進一步選擇了與肝臟聯(lián)系比較緊密的BMP家族成員BMP2、BMP7，探究其與肝干細胞之間的關(guān)系。

肝細胞生長因子HGF在促進肝細胞分化、生長發(fā)育中起作用，至今仍被認為是最強有力的致分裂增殖子[19]。HGF能有效促進誘導(dǎo)肝細胞的成熟分化，是最早被認識在肝再生過程中起重要作用的細胞因子之一，其作用機制是通過HGF/C-met系統(tǒng)相互作用而促進多種細胞的有絲分裂及形態(tài)形成，在肝臟的發(fā)育成熟、再生和組織重建中發(fā)揮著重要作用[20]。本實驗選用細胞因子HGF作為HP14.5細胞誘導(dǎo)的陽性對照組，通過與HGF誘導(dǎo)效果的對比，觀察實驗組BMP2、BMP7對肝干細胞的誘導(dǎo)情況。

ALB是反映肝干細胞向成熟肝細胞樣細胞分化活性和功能的良好指標，成熟的肝細胞表達ALB。本實驗選取BMP2、BMP7、HGF作為誘導(dǎo)因子分別感染小鼠胚胎肝干細胞，通過ALB-Gluc報告基因熒光素酶檢測和免疫熒光等方法，檢測成熟肝細胞特異性指標ALB的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，BMP2組、HGF組ALB的表達增加，而BMP7組和GFP對照組變化不明顯，進一步進行PAS染色和尿素合成檢測，發(fā)現(xiàn)BMP2對HP14.5有誘導(dǎo)作用，這與文獻報道的BMP2在肝臟再生方面具有一定作用有相關(guān)性[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)BMP2對肝干細胞具有定向誘導(dǎo)作用，但目前對其誘導(dǎo)肝臟分化的信號途徑的下游事件還不清楚，但BMP7誘導(dǎo)后在肝細胞標志物及合成分泌的功能檢測中和GFP對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示BMP7雖然在誘導(dǎo)成骨、軟骨方向有一定作用，但BMP7對于肝干細胞無明顯誘導(dǎo)作用。BMP2是誘導(dǎo)肝干細胞定向分化為肝細胞的重要細胞因子，而BMP7是否通過其他信號分子介導(dǎo)而對肝干細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)作用目前仍不清楚，下一步我們將研究BMP2與HGF的協(xié)同作用，在后續(xù)實驗中進一步驗證其對HP14.5的誘導(dǎo)作用。

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The effecf of bone morphogenetic proteins 2, 7 in inducing murine embryonic stem cells into hepatic cells in vitro

CHEN Cong, KANG Quan*, LUO Qing, DIE Xiao-hong, TIAN Wen
Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Department of Hepatobiliary Surgery, Children's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China
*

, E-mail: kq1028@yahoo.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30973062, 81172545), the Natural Science Foundation of Chongqing Province (CSTC2012jjA10120) and the Key Subject of Chongqing Medical University (XBZD201015)

ObjectiveTo explore the effect of recombinant adenovirus-mediated bone morphogenetic proteins 2, 7 (Adv-BMP2, Adv-BMP7) in inducing transformation of murine embryonic hepatic progenitor cells to mature hepatic-like cells.MethodsHP14.5 cells were divided into 4 groups, and then infected by recombinant adenovirus expressing BMP2, BMP7, hepatocyte growth factor (HGF), and green fluorescent protein (GFP), respectively. For investigating the differential regulation of HP14.5 cells, the luciferase report gene was detected at the 1st, 4th and 7th day post infection, the expression of hepatocyte marker albumin (ALB) was detected at the 7th day after infection by cellular immunofluorescence assay. The maturation and differentiation of HP14.5 cells were examined by PAS staining and urea nitrogen synthesis of the cells at day 4, 7 and 10 post-infection.ResultsThe expression of ALB with BMP2 and HGF increased significantly compared to that in GFP control group tested by luciferase report gene; cellular immunofluorescence assay indicated that the specific marker of mature hepatocyte ALB was strong expressed at day 7 post-infection, while a negative result was observed in the GFP control group; HP14.5 cells infected with BMP2 and HGF have also acquired functional characteristics of hepatocytes which synthesized and secreted urea nitrogen, and stored glycogen. However, less inductive activity was found in BMP7 group.ConclusionBMP2 may induce the differentiation of HP14.5 cells into mature hepatocyte-like cells with initial synthesis and secretion, but BMP7 may have no such a capability.

bone morphogenetic proteins; hepatic progenitor cells; cell differentiation; recombinant adenovirus

R329.21；R329.28；R394.2

A

0577-7402(2013)04-0260-05

2012-09-07；

2013-01-10)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金(30973062、81172545)；重慶市自然科學(xué)基金(CSTC2012jjA10120)；重慶醫(yī)科大學(xué)校際重點課題(XBZD201015)

陳聰，住院醫(yī)師，碩士研究生。主要從事肝臟干細胞誘導(dǎo)分化方面的研究

400014 重慶 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室、兒科學(xué)重慶市重點實驗室、重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院肝膽外科(陳聰、康權(quán)、羅慶、迭小紅、田雯)

康權(quán)，E-mail：kq1028@yahoo.com