魏玉香，周文強(qiáng)，肖漓，鄭德華，齊幟，蔡明，錢葉勇，于濤，廖珂，石炳毅

調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞對皮膚移植小鼠IL-10+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的影響

魏玉香，周文強(qiáng)，肖漓，鄭德華，齊幟，蔡明，錢葉勇，于濤，廖珂，石炳毅

目的探討吞噬了供者凋亡淋巴細(xì)胞的未成熟樹突細(xì)胞(imDC)對皮膚移植受體小鼠外周血IL-10+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)比例及移植物存活時間的影響。方法以C57BL/6小鼠作為受者，BALB/c小鼠為供者，建立小鼠皮膚移植模型。分離C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng)小鼠重組白細(xì)胞介素4(IL-4)和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)共同誘導(dǎo)，制備并培養(yǎng)imDC。分離BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞(SP)，經(jīng)光化學(xué)照射方法(PUVA)處理，得到供者小鼠脾淋巴細(xì)胞(PUVA-SP)。在體外將PUVA-SP與C57BL/6小鼠骨髓來源的imDC共同培養(yǎng)，得到PUVA-SP DCs。根據(jù)受體小鼠術(shù)前接受的靜脈輸注成分將其隨機(jī)分為4組(n=14)：PUVA-SP DC組、imDC組、成熟樹突細(xì)胞(maDC)組和PBS對照組。于手術(shù)前7d分別從尾靜脈注入1×l06個(0.2ml)PUVA-SP DC、imDC、maDC或0.2ml PBS。于移植術(shù)后觀察受體小鼠的移植物存活時間、外周血IL-10+CD19+Breg比例及IL-10的表達(dá)情況。結(jié)果移植術(shù)后，受體小鼠外周血IL-10+CD19+Breg細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞的比例在PUVA-SP DC組為7.48%，明顯高于imDC組(4.12%)、maDC組(3.01%)和PBS對照組(2.37%)。PUVA-SP DC組小鼠血清中IL-10表達(dá)水平為58.2±0.9ng/ml，與maDC組(20.1±1.6ng/ml)、imDC組(26.2±1.3ng/ml)及PBS對照組(19.0±0.6ng/ml)比較顯著升高(P＜0.01)。PUVA-SP DC組移植物存活時間為62.3±2.6d，顯著長于maDC組(20.7±1.9d)、imDC組(12.1±1.0d)和PBS對照組(11.0±1.3d，P＜0.01)。結(jié)論移植術(shù)前輸注PUVA-SP DCs可顯著延長移植物存活時間，增加受者體內(nèi)IL-10的表達(dá)水平，誘導(dǎo)產(chǎn)生較多分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。

樹突細(xì)胞；皮膚移植；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞

樹突細(xì)胞(dendritic cells，DC)作為體內(nèi)最有效的抗原呈遞細(xì)胞，不但具有免疫激活作用，而且在一定狀態(tài)下可誘導(dǎo)免疫耐受[1-2]。本課題組前期制備了一種未成熟的樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDC)，在吞噬了異基因供體大鼠凋亡淋巴細(xì)胞后仍然維持不成熟狀態(tài)，由于采用了光化學(xué)照射的方法(如PUVA)處理異基因供體大鼠淋巴細(xì)胞促使其發(fā)生凋亡，故將這種imDC命名為PUVA-SP DC。給移植受者輸注這種PUVA-SP DC能誘導(dǎo)受者T細(xì)胞的免疫低反應(yīng)性，使受者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明顯增加，移植物存活時間明顯延長[3]，提示其具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。B細(xì)胞除了能通過產(chǎn)生抗體在體液免疫中發(fā)揮中心作用以外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用。為了探討皮膚移植受體小鼠接受具有獨特調(diào)節(jié)功能的PUVA-SP DC會對小鼠體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生何種效應(yīng)，本實驗建立了小鼠皮膚移植模型，研究負(fù)載供者PUVA-SP的受者imDC對移植小鼠產(chǎn)生分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2Kb)近交系小鼠，4～6周齡，雄性，SPF級，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。

1.2 實驗器材與試劑 長波紫外線(UVA)光源為北京電光源研究所研制。紫外線照射儀購自北京師范大學(xué)。autoMACS細(xì)胞分選儀為德國Miltenyi Biotec產(chǎn)品。FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國Bacton Dickinson產(chǎn)品。小鼠重組白細(xì)胞介素4(rmIL-4)和重組粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)購自Peprotech公司。小鼠淋巴細(xì)胞分離液為天津市TBD生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自PAA Laboratories。脂多糖(LPS)、光敏劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen，8-MOP)購于Sigma公司?？笴D11c 磁珠購自Miltenyi Biotec公司。熒光素標(biāo)記的單抗CD19、IL-10以及同型對照抗體購自BD PharMingen公司。細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10 ELISA檢測試劑盒為R&D公司產(chǎn)品。

1.3 C57BL/6小鼠未成熟樹突細(xì)胞(imDC)和成熟樹突細(xì)胞(maDC)的培養(yǎng) 骨髓來源的小鼠樹突細(xì)胞的培養(yǎng)參考Inaba等[4]的方法并稍作改進(jìn)：頸椎脫位法處死C57BL/6小鼠，無菌取股骨和脛骨，用注射器反復(fù)沖洗，收集得到骨髓細(xì)胞懸液，1 000×g離心5min，棄上清，加入2ml無菌Tris-NH4Cl溶液裂解紅細(xì)胞，1 000×g離心5min，棄上清。洗滌后的細(xì)胞用含10% 胎牛血清(FCS)、20ng/ml rmGM-CSF、10ng/ml rmIL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮，分至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入約4ml培養(yǎng)基，細(xì)胞密度2×106/ml。細(xì)胞在37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48h后，輕輕吹洗除去懸浮細(xì)胞，僅保留疏松貼壁細(xì)胞，加入新鮮的含10% FCS、20ng/ml rmGM-CSF、10ng/ml rmIL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基，取5～6d時的未成熟imDC在低濃度LPS(10ng/ml)刺激下繼續(xù)培養(yǎng)至第8天以達(dá)到成熟狀態(tài)。用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細(xì)胞，無菌條件下用抗CD11c磁珠進(jìn)行分選，可得到實驗所需骨髓來源的小鼠imDC和maDC。

1.4 BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液(SP)的制備及PUVA處理 頸椎脫位法處死BALB/c小鼠，無菌切取脾臟，移入4℃ PBS中，剪碎后經(jīng)100目篩網(wǎng)充分研磨，200目篩網(wǎng)過濾去除殘渣，獲單細(xì)胞懸液，采用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll密度梯度法，以1 600r/min離心20min，取單個核細(xì)胞層，加RPMI 1640液重復(fù)洗滌2次，并懸浮細(xì)胞，置塑料平皿中，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30min后，除去貼壁的單核細(xì)胞，獲得懸浮的脾淋巴細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色法計算活細(xì)胞百分率，活細(xì)胞＞90%用于實驗。

采用8-MOP聯(lián)合A波段長波紫外線(UVA)照射的體外光化學(xué)方法(psoralen+UVA treatment for eczema，psoriasis，graft-versus-host disease，PUVA)處理鼠脾淋巴細(xì)胞。向上述脾淋巴細(xì)胞中加入200ng/ml 8-MOP，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中孵育20min，然后在距離UVA光源20cm處直接照射9min，照射強(qiáng)度2J/cm2。照射結(jié)束后，用RPMI 1640重復(fù)洗滌2次；用含10%FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，即得到PUVA處理后的供者小鼠脾淋巴細(xì)胞(PUVA-SP)。

1.5 吞噬經(jīng)PUVA處理的異基因淋巴細(xì)胞的樹突細(xì)胞(PUVA-SP DC)的制備 在DC培養(yǎng)的第6天，加入經(jīng)PUVA處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞(PUVA-SP)，以PUVASP:DC=5:1的比例，共培養(yǎng)16h，去除懸浮細(xì)胞，即可得到吞噬PUVA-SP的imDC，稱為PUVA-SP DC。

1.6 小鼠皮膚移植排斥模型的建立 以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體。供體鼠剪毛后，浸入0.5%新潔爾滅溶液中消毒15min，取軀干部全層皮膚，清除皮下組織，制成直徑18mm的圓形皮片，保存于4℃生理鹽水中備用。受體鼠在戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉下，剪去背部相應(yīng)面積的皮膚，徹底止血后植入供皮皮片。

1.7 實驗分組及處理 在皮膚移植前將受體鼠分為4組(n=14)：PUVA-SP DC組、imDC組、maDC組和PBS對照組，根據(jù)分組在移植手術(shù)前7d經(jīng)尾靜脈分別注射1×l06個PUVA-SP DC、imDC、maDC或等體積(0.2ml)PBS。

1.8 外周血細(xì)胞因子檢測 于術(shù)后6d取尾靜脈血，分離血清，ELISA法檢測受者外周血中IL-10和IFN-γ濃度，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 IL-10+CD19+調(diào)節(jié)性B(Breg)細(xì)胞比例的檢測對CD19+B細(xì)胞進(jìn)行染色，計算IL-10+CD19+Breg細(xì)胞的比例。染色參考Yanaba等[5]的方法并稍作改進(jìn)：將純化的外周血淋巴細(xì)胞(2×106/ml)重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基，加入刺激劑LPS(10μg/ml)、佛波酯(PMA，50ng/ml)、離子霉素(ionomycin，500ng/ml)，同時加入布雷菲德菌素(abrefeldin A，10μg/ml)，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，收集細(xì)胞，使用BD Cytofix/CytopermTM試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀對IL-10+CD19+Breg細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受體鼠血清IL-10的表達(dá)水平 PUVA-SP DC組、maDC組、imDC組和PBS對照組小鼠血清IL-10水平分別為58.2±0.9、20.1±1.6、26.2±1.3和19.0±0.6ng/ml。maDC組與PBS對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。imDC組略高于PBS對照組和maDC組，但差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。PUVASP DC組較PBS對照組、maDC組及imDC組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 輸注PUVA-SP DC對受體鼠分泌IL-10 B細(xì)胞比例的影響 由圖1可見，PUVA-SP DC 組小鼠外周血分泌IL-10的B細(xì)胞比例為7.48%，明顯高于maDC組(3.01%)、imDC組(4.12%)和PBS對照組(2.37%)。maDC組和imDC組小鼠分泌IL-10 B細(xì)胞的比例略高于PBS對照組。

圖1 小鼠外周血IL-10+CD19+Breg細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞的比例Fig. 1 Proportion of IL-10+CD19+Breg cells among CD19+B cells in the peripheral blood of mice

2.3 輸注PUVA-SP DC對受體小鼠移植皮片存活的影響 PUVA-SP DC組小鼠移植皮片存活期為62.3±2.6d，顯著長于maDC組(20.7±1.9d)、imDC組(12.1±1.0d)和PBS對照組(11.0±1.3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。輸注maDC、imDC組移植皮片存活時間略長于PBS對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

3 討 論

本課題組前期采用PUVA處理外周血淋巴細(xì)胞，并促進(jìn)imDC吞噬PUVA處理后的淋巴細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PUVA可促使大量大鼠淋巴細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，而大鼠DC吞噬了凋亡的異基因供體大鼠淋巴細(xì)胞后，仍能維持其不成熟狀態(tài)，命名為PUVA-SP DC，其表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ(OX6)呈低水平表達(dá)[3]。給移植受者輸注這些DC后，能誘導(dǎo)受者T細(xì)胞的免疫低反應(yīng)性，使受者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明顯增加，移植物存活時間明顯延長[3]。由此，我們認(rèn)為PUVA-SP DC具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能。

圖2 輸注不同種類DC對小鼠同種異體皮膚移植存活時間的影響Fig.2 Effect of infusing different types of DC on the survival time of skin allograft in mice

多種免疫效應(yīng)細(xì)胞及其表達(dá)的免疫相關(guān)分子的相互作用所構(gòu)成的免疫網(wǎng)絡(luò)是免疫識別與免疫調(diào)控、免疫應(yīng)答與免疫耐受的基礎(chǔ)。免疫系統(tǒng)通過刺激免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受這兩種互補(bǔ)的功能維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。在此動態(tài)過程中，DC與周圍很多免疫細(xì)胞存在相互作用，彼此精細(xì)調(diào)節(jié)[6]。近年來，相關(guān)研究主要集中在DC和T細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生的免疫激活或免疫耐受方面[7-9]。B細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的主要細(xì)胞，能通過產(chǎn)生抗體在體液免疫中發(fā)揮核心作用。最近研究表明，與T細(xì)胞一樣，B細(xì)胞也具有異質(zhì)性，根據(jù)其分泌細(xì)胞因子的不同，可分為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和效應(yīng)性B細(xì)胞亞群[10-11]，其中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞主要分泌IL-10或TGF-β1等免疫負(fù)向調(diào)節(jié)因子。2006年，Mizoguchi和Bhan[12]首次使用調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的概念來定義具有負(fù)向調(diào)控功能的B細(xì)胞。隨后，Evans等[13]發(fā)現(xiàn)了過渡2型邊緣帶前體(transitional 2 marginal zone precursor，T2 MZP) Bregs。T2 MZP Bregs通過產(chǎn)生IL-10抑制CD4+T細(xì)胞分化及效應(yīng)T細(xì)胞的活性，從而抑制過度的炎癥反應(yīng)[13-14]。2008年，有研究者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞亞群能夠抑制T細(xì)胞增殖及T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，他們將B10細(xì)胞回輸至CD19-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)原本增強(qiáng)的CD4+T細(xì)胞依賴性超敏反應(yīng)恢復(fù)至正常水平，并證明B細(xì)胞的抗原特異性是通過IL-10介導(dǎo)的抑制功能實現(xiàn)的[5,15]。IL-10是體內(nèi)重要的免疫負(fù)向調(diào)控分子，可通過下調(diào)主要組織相容性抗原、共刺激分子及抑制多種促炎細(xì)胞因子的分泌而誘導(dǎo)耐受性DC、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th2細(xì)胞的生成，從而直接或間接抑制淋巴細(xì)胞的活化，使其在促炎因子的作用下仍能誘導(dǎo)異基因抗原特異性免疫耐受，降低免疫抑制劑的非特異性免疫抑制所造成的感染及腫瘤擴(kuò)散風(fēng)險。本研究結(jié)果表明，在移植術(shù)前輸注PUVA-SP DC可顯著延長移植物存活時間，在促使受者體內(nèi)產(chǎn)生較多負(fù)向免疫調(diào)節(jié)因子IL-10的同時，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生較多分泌IL-10的Bregs。該結(jié)果有助于更好地理解PUVA-SP DC參與免疫調(diào)控的機(jī)制，豐富調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)控功能，為體外光化學(xué)療法應(yīng)用于器官移植免疫排斥的治療提供理論基礎(chǔ)。

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Effect of regulatory dendritic cells on IL-10-producing regulatory B cells of skin allograft in mice

WEI Yu-xiang, ZHOU Wen-qiang, XIAO Li, ZHENG De-hua, QI Zhi, CAI Ming, QIAN Ye-yong, YU Tao, LIAO Ke, SHI Bing-yi*
Organ Transplantation Institute, Beijing Key Organ Transplantation and Immune Regulation Laboratory, 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China
*

, E-mail: shibingyi@medmail.com.cn
The work was supported by the China Postdoctoral Science Fund (200902680 and 20080441308), the Special Fund from Beijing Science & Technology Commission (Z111102055311086) and the National Natural Science Youth Foundation of China (81102242)

ObjectiveTo investigate the effect of recipient immature dendritic cells (imDCs) loaded with PUVA-treated donor apoptotic splenic lymphocytes (PUVA-SP DC) on IL-10+CD19+regulatory B cells (Breg) and the survival duration of skin allograft in mice.MethodsBone marrow-derived DCs of C57BL/6 mice were obtained from bone marrow cells by co-culturing with recombinant mouse IL-4 and GM-CSF. Spleen lymphocytes (SP) of BALB/c mice were isolated and prepared as PUVA- SP by treating the cells with 8-methoxypsoralen plus ultraviolet A irradiation. The bone marrow-derived imDCs of C57BL/6 mice were co-cultured with PUVA-SP of BALB/c mice to obtain PUVA-SP DCs. The skin allograft model was then established. Animals were randomly grouped according to different pretreatments as follows: the control group was iv. introduction of PBS (0.2ml) alone 7 days before skin transplantation, the PUVA-SP DC group

an iv. injection of PUVA-SP DCs, the maDC (mature DC) group received recipient maDCs, and the imDC group was given recipient imDCs. Mice were monitored daily from day 6 after transplantation for signs of rejection of skin graft. The recipients′ peripheral blood serum samples were then collected and the level of cytokines were measured by using ELISA kits. The survival time of skin allograft was evaluated every day. The expression of IL-10+CD19+regulatory B cells was analyzed by flow cytometry.ResultsAfter transplantation, the proportion of IL-10+CD19+Breg in the peripheral blood of PUVA-SP DC group was 7.48%, which was obviously higher than that of imDC group (4.12%), maDC group (3.01%) and control group (2.37%). The serum level of cytokine IL-10 in PUVA-SP DC group was 58.2±0.9ng/ml, and it was significantly higher than that in maDC group (20.1±1.6ng/ml), imDC group (26.2±1.3ng/ml) and control group (19.0±0.6ng/ ml, P＜0.01). The survival time of allograft in PUVA-SP DC group was 62.3±2.6d, and it was markedly longer than that in maDC group (20.7±1.9d), imDC group (12.1±1.0d) and control group (11.0±1.3d, P＜0.01).ConclusionsAdministration of PUVASP DCs, in the absence of an immunosuppressant, may significantly delay allograft rejection. This effect is associated with upregulation of circulating regulatory B cells with preferential IL-10 secretion.

dendritic cells; skin transplantation; B-lymphocytes, regulatory

R392.4

A

0577-7402(2013)04-0274-05

2013-01-09；

2013-03-04)

(責(zé)任編輯：李恩江)

中國博士后基金(200902680，20080441308)；北京市科技專項2011階梯計劃項目(Z111102055311086)；國家自然科學(xué)基金青年基金(81102242)

魏玉香，醫(yī)學(xué)博士。主要從事器官移植免疫方面的研究

100091 北京 解放軍309醫(yī)院全軍器官移植研究所，器官移植與免疫調(diào)節(jié)北京市重點實驗室(魏玉香、周文強(qiáng)、肖漓、鄭德華、齊幟、蔡明、錢葉勇、于濤、廖珂、石炳毅)

石炳毅，E-mail：shibingyi@medmail.com.cn